Interferentes no ensaio de LAL

O teste de lisado de amebócitos de Limulus, conhecido como LAL, serve para determinar a presença de endotoxinas bacterianas vindas da parede celular das bactérias Gram-negativas. O teste de LAL é feito desde a descoberta, há mais de seis décadas, em que o sangue do caranguejo ferradura, Limulus Polyphemus, se coagula na presença das endotoxinas bacterianas. Os lipopolissacarídeos que são as espécies químicas consideradas tóxicas ao ocorrer a lise celular das bactérias Gram-negativas, ativam uma série de reações em cascata que são produzidas na hemofilia do caranguejo ferradura, provocando finalmente uma turbidez na amostra; sendo este o sinal analítico para desenvolvimento do ensaio de LAL.

No entanto, existem outros fatores que provocam o aparecimento de turbidez em uma amostra que contém um lisado de amebócitos de Limulus, ou porque ativam a mesma série de reações que as endotoxinas ou porque causam a formação da coagulina, proteína que causa a formação do gel, que faz com que apareça a turbidez na solução, ao sofrer o processo de coagulação.

Entre os fatores que interferem na detecção de endotoxinas pelo teste de LAL, podemos citar:

• O pH, que deve ficar entre 6,4 e 8. No caso de serem usados testes comerciais, deve-se ler atenciosamente as indicações do fabricante e, embora na maioria dos casos já tenham alguma substância que age como tampão incluída, comprovar que o pH está entre os valores indicados.

• A força iônica do meio também é um fator a ser considerado. Em soluções com alta concentração de íons ocorrem processos de agregação entre as moléculas de lipopolissacarídeos que fazem com que se determine uma quantidade de endotoxinas menor que a real.

• Interferências devido à presença de substâncias orgânicas com propriedades quelantes ou anticoagulantes que impedem a formação de gel, indicativo da quantidade de endotoxinas. Um exemplo deste tipo de substância é a heparina.

• Oxidantes ou outro tipo de compostos capazes de desnaturar as enzimas necessárias para que ocorra toda a cascata de reações que provocam a formação do gel de coagulina, ou qualquer substância que iniba a ação destas enzimas.

• Interferentes que imitam a ação das endotoxinas como podem ser as serina proteasas, os (1→3)-ß-D-glucanos, os filtros celulósicos, entre outros.

MAIS SOBRE LAL: A determinação de endotoxinas bacterianas: Como evitar a contaminação das amostras durante a manipulação?

Nos casos em que o teste de LAL é feito usando o método de detecção cromogênico, qualquer fator que interfira na medição da cor da amostra também é considerado um interferente na análise. O mais comum nestes casos é que a amostra a analisar contenha algum composto colorido que seja absorvido na zona do espectro, e onde a banda de absorção tenha o corante usado na medição.

O teste que a Wako desenvolveu para fazer a determinação de endotoxinas pelo método colorimétrico é o Limulus Color KY, que é vendido como um kit para um único teste ou para múltiplos testes. Ele se baseia em um procedimento cinético cromogênico, em que o desenvolvimento da cor é proporcional à quantidade de endotoxinas presentes na amostra. A medição da cor pode ser feita com um leitor de placas ou um leitor de tubos, tendo como limite de detecção 0.0002 UE/mL (um teste único) y 0.0005 UE/mL (múltiplos testes).

A interferência das proteases e outras enzimas que a amostra contém pode ser eliminada mediante o aquecimento, e a dos (1→3)-ß-D-glucanos, pode-se combater estudando os contaminantes que causam a presença destes compostos na amostra para erradicá-los, ou mediante outros métodos.

Esta interferência acontece porque os (1→3)-ß-D-glucanos interagem com o fator enzimático G que intervém na cascata de reações para a formação do gel de coagulina.

Os testes vendidos pela Wako contêm glucanos adicionados, em forma de curdlan carboximetilado, na mistura de reagentes necessários para a análise. Ao adicionar o derivado de curdlan,o processo de gelificação fica insensível à presença de (1→3)-ß-D-glucanos, e esta característica é aproveitada nos kits da série Pyrostar para eliminar esta interferência.

Além dos kits para determinar a presença de endotoxinas pelos diferentes métodos, Wako vende uma série de acessórios e reagentes úteis para realizar estes ensaios, como são os tubos com tampa de alumínio (Limulus Test Tube-S with Aluminum Cap), a água destilada livre de endotoxinas ou a controle padrão de endotoxina (CPE).

Bibliografia:

1) Iwanaga S., Curr Opin Immunol., 5, 74-82, 1993.

2) Ketcchum PA, Parsonnet J, Stotts LS, Nocvitsky TJ, Scchlain B, Bates DW., J Endotox Res., 4(1), 9-16., 1997.

3) J. Kambayashi, M. Yokota, M. Sakon, E. Shiba, T. Kawasaki, T. Mori, M. Tsuchiya, H. Oishi, S. Matsuura, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 22, 2, 93-100, 1991.

ACESSÓRIOS E REAGENTS LAL

Teste de Limulus PS Wako	PYROSTAR™ ES-F Único Teste Vial	Solución extractora de endotoxina