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A importância do uso do glucano nos ensaios de LAL

8th June 2015

A importância do uso do glucano nos ensaios de LALAtravés do ensaio de LAL (lisado de amebocitos de Limulus) pode-se determinar a presença de endotoxinas bacterianas em diferentes meios, soluções, material de laboratório, ar, entre outros. Este estudo teve grande importância na indústria e na pesquisa nas últimas décadas, estabelecendo-se como o estudo mais confiável para a detecção de pirogênios. O ensaio de LAL se baseia na cadeia de reações que as endotoxinas bacterianas provocam, provenientes das bactérias Gram-negativas, na hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus, o caranguejo ferradura, nome comum como é conhecido este caranguejo. A cadeia de reações tem como resultado a coagulação da hemolinfa que é o fenômeno utilizado para a determinação analítica. No entanto, existem outros compostos que também provocam a gelificação no lisado de amebócitos do caranguejo ferradura, provocando interferência no ensaio de endotoxinas bacterianas, alguns destes compostos são (1,3)-β-D-glucanos, que resultam em falsos positivos no ensaio de LAL.

Os (1,3)-β-D-glucanos são compostos polissacarídeos, constituídos por monômeros de glicose, especificamente monômeros de D-glicose unidos através de ligações β-glicosídicas, que são produzidas por muitos organismos procarióticos e eucarióticos. Uma das principais fontes de contaminação de glucanos nos laboratórios vem da celulose do papel, pois estes compostos se encontram na parede celular das células das árvores. Como a operação de filtragem é muito frequente nos laboratórios, e esta é realizada em muitas ocasiões com papel de filtro de celulose, é comum que as amostras estudadas para a detecção de endotoxinas bacterianas contenham (1,3)-β-D-glucanos. As amostras também podem estar contaminadas pelo contato com outros organismos produtores de glucanos.

Os glucanos também são considerados como patógenos nos mamíferos, assim em algumas pesquisas não é um problema que se obtenha um resultado alterado no ensaio de LAL pela presença de glucanos. Os glucanos são considerados moléculas proinflamatórias e com atividade imunológica, e também são capazes de ativar os linfócitos, macrófagos e a cascata de complemento. Porém, na prática, é frequente que o pesquisador precise conhecer a concentração de endotoxinas bacterianas sem a interferência dos glucanos. Isto acontece, principalmente, quando o ensaio de LAL é usado como método de detecção de pirogênios, já que os glucanos em geral são substâncias que não causam febre.

VER TAMBÉM: O impacto das endotoxinas sobre o corpo humano

No ensaio de LAL um resultado positivo é dado pela gelificação que ocorre na dissolução devido à formação da proteína coagulina, que é uma das substâncias obtidas pela cadeia de reações que desencadeia o fator C que existe na hemolinfa do caranguejo, na presença de endotoxinas bacterianas. Quando as substâncias exógenas presentes são (1,3)-β-D-glucanos, o fator G é ativado, mas também dá lugar a que se produza a coagulina, portanto, o resultado é igual se existem endotoxinas bacterianas presentes na solução. Uma alternativa para eliminar a interferência dos glucanos no teste de LAL é remover o fator G do lisado de amebócitos, que é parte reativa, ou inibir a reação que é produzida entre o fator G e o glucano.

Os glucanos contaminantes podem vir de diferentes organismos, por exemplo, a zymosan das leveduras, a laminarina de algas, o lentinano que é utilizado como remédio antitumoral, extraído do cogumelo shitake ou o clurdana, produzido pelas bactérias. Na Wako se utiliza especificamente o curdlana obtido de bactérias para realizar a metilação e obter o clurdana carboximetilado que, adicionado em grandes quantidades ao meio onde se realiza o ensaio de LAL, faz com que os glucanos não interfiram nas medições. Assim, os testes disponíveis na Wako para a determinação de endotoxinas bacterianas mediante o ensaio de LAL das séries Pyrostar ES-F, Limulus Color KY e Limulus PS, contêm na mistura de reagentes liofilizados o curdlana carboximetilado.

Outros reagentes e materiais disponíveis na Wako para a realização do ensaio de lisado de amebócitos de Limulus são:

  • Solução extratora de endotoxinas (Solução Extratora de Endotoxina para Teste LAL), que contém albumina de soro humano, substância que faz com que a extração de endotoxinas das amostras seja realizada com maior eficiência do que se for feita apenas com solução salina.

Existem outros fatores que podem causar interferências no método de LAL, como o pH, uma alta concentração de sais ou a presença de moléculas quelantes como pode ser a heparina, porém, estes temas serão tratados em maior profundidade em outro artigo que publicaremos em breve neste blog.

Bibliografia:

1) James F. Cooper, Marlys E. Weary and Foster T. Jordan, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 51, 1, 2-6, 1997.

2) Wiederhold, N.P., Najvar, L.K., Vallor, A.C., Kirkpatrick, W.R., Bocanegra, R., Molian, D., Olivo, M., Graybill, J.R., and Patterson, T.F., Agents Chemother., 52; 1176-1178, 2008.

3) Pool, J., Joharr, G., James, S., Petersen, I., Bouic, P., Journal of Immunoassay, 20, 79-89, 1997.

4) Roslansky, P. F., Novitsky, T. J., Journal of Clinical Microbiology, Nov., 2477-2483, 1991.

LINHA DE PRODUTOS LAL

Teste de Limulus PS PYROSTAR™ ES-F/Plate com CPE Toxinometer® ET-6000
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Lisa
Por: Lisa Komski Em: Kit LAL