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Uso do Método Colorimétrico no teste de LAL

30th November 2018

Uso do Método Colorimétrico no teste de LALOs métodos de análise colorimétrica permitem, através da medição da variação de absorbância de uma amostra a um determinado comprimento de onda, calcular a concentração dos analitos de interesse. Este método de detecção pode ser usado no teste de LAL (lisado de amebócitos de Limulus) para endotoxinas.

O teste de LAL é uma técnica bem conhecida pelos pesquisadores para a determinação de endotoxinas da membrana celular das bactérias Gram-negativas. Este teste foi desenvolvido na década de 1960, quando foi aproveitado o fato de que a hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus sofria um processo de coagulação na presença de endotoxinas para se tornar uma técnica analítica.

 A cascata de reações enzimáticas que ocorre nos amebócitos de Limulus na presença de endotoxinas bacterianas, dá origem à formação de coagulina, que provoca a turbidez no meio de reação. Estas mesmas reações rompem as ligações peptídicas que ligam a p-nitroanilina com uma proteína, portanto, esse corante pode ser usado como um sinal de que reações de defesa estão ocorrendo no lisado de amebócitos. A p-nitroanilina livre é de cor amarela e permite o uso de um método cromogênico para a detecção de endotoxinas. Com o uso de um espectrofotômetro, a concentração de corante liberado durante as reações enzimáticas induzidas pela endotoxina é quantificada.

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Os métodos de análise óptica são simples e baratos, portanto, dependendo das características da amostra, eles são o método de escolha para a quantificação de endotoxinas. Para aplicar o método cromogênico no teste LAL para detecção de endotoxina bacteriana, a análise pode ser realizada pelo método cromogênico do ponto final ou pelo método cromogênico cinético.

O método cromogênico cinético baseia-se na medição da cor da amostra de teste em diferentes intervalos de tempo após a adição do reagente de LAL contendo a substância colorida. Como vantagem deste método, temos que ele pode ser automatizado, economizando tempo e permitindo um maior número de medições. Tem como desvantagem que não pode ser aplicado quando existem outras moléculas com cor que podem causar interferências. A banda de absorção da p-nitroanilina é de cerca de 400 nm, onde também absorvem uma grande quantidade de grupos cromóforos.

O método cromogênico do ponto final, por outro lado, baseia-se na medição da absorvância da amostra quando a reação está terminada, o que, de acordo com o kit de teste, pode ser no final do período de incubação ou quando a solução é acidificada. Embora o método seja cromogênico e ofereça as mesmas vantagens que o método cinético, ele tem a clara desvantagem de que o resultado é obtido apenas de uma medida e não de várias, como no cinético. Se a medição feita tiver um erro, não há como verificar isso mesmo replicando o teste (o que leva a um gasto maior de reagentes); portanto, há uma chance maior de obter resultados falsos. Devido a essa desvantagem, o método cromogênico do ponto final é utilizado apenas para realizar testes qualitativos ou quando, por razões de interferência, é necessário formar um derivado da p-nitroanilina liberada quando a reação é concluída. Desta forma, é possível realizar medições em amostras contendo corantes que interferem na zona de absorção da p-nitroanilina.

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Lisa
Por: Lisa Komski Em: Kit LAL Tags: Teste de LAL