Causas para o fenômeno de Baixa Recuperação de Endotoxinas (BRE) e como difere da interferência típica

As endotoxinas são pirogênios que podem ser encontrados na membrana externa de bactérias gram-negativas e podem causar febre e sepse, se tiverem acesso à corrente sanguínea humana. Para garantir a segurança do paciente, medicamentos e dispositivos médicos administrados por via parenteral são submetidos a testes rigorosos para contaminação por endotoxinas. No entanto, fenômenos como baixa recuperação de endotoxinas e interferência típica com o ensaio LAL podem levar a resultados de testes imprecisos [1]. 

O que é baixa recuperação de endotoxinas? 

O termo baixa recuperação de endotoxinas descreve o fenômeno de recuperação significativamente reduzida de endotoxina enriquecida de certas matrizes ao longo do tempo. Tal redução de endotoxina detectável ao longo do tempo pode levar à quantificação imprecisa de endotoxina com o ensaio de lisado de amebócito Limulus (LAL). 

A que riscos está associada a baixa recuperação de endotoxinas? 

O fenômeno de baixa recuperação de endotoxinas é uma preocupação para os fabricantes de fármacos administrados por via parenteral, porque a capacidade de detectar e quantificar contaminantes de endotoxinas que ocorrem naturalmente em certas matrizes também pode diminuir ao longo do tempo. Como resultado, o risco de obter resultados falso-negativos do teste de endotoxina pode aumentar. 

Como a baixa recuperação de endotoxinas é diferente da interferência típica do ensaio LAL? 

Tanto a baixa recuperação de endotoxinas quanto a interferência típica do ensaio LAL podem levar a resultados de testes imprecisos e não confiáveis. No entanto, seus mecanismos e as estratégias para sua detecção e eliminação diferem. 

Diferenças nos mecanismos subjacentes à baixa recuperação de endotoxinas e interferência típica do ensaio LAL 

A baixa recuperação de endotoxinas pode ocorrer quando a endotoxina é mascarada ou sequestrada na matriz de um medicamento. Os excipientes de fármacos podem desempenhar um papel neste processo, alterando o estado de agregação da endotoxina, tornando-a menos acessível ou reativa ao reagente LAL. Consequentemente, uma quantidade reduzida de endotoxina pode ser detectada, mesmo que ainda esteja presente na matriz. Geralmente, o fenômeno de baixa recuperação de endotoxinas é dependente do tempo e também pode ser dependente da temperatura. 

Em contraste, na interferência típica do ensaio LAL, uma substância na amostra testada interfere com o reagente ou cascata de LAL, inibindo ou intensificando a reação de LAL. Uma inibição da reação LAL pode levar à subestimação da endotoxina e resultados falso-negativos. Os fatores que podem inibir a reação de LAL incluem um pH fora da faixa ideal de 6–8; presença de metais pesados, agentes quelantes ou inibidores enzimáticos; e concentrações elevadas de sal. Um aumento da reação de LAL pode levar à superestimação do teor de endotoxinas e resultados falso-positivos. Fatores que podem aumentar a reação de LAL incluem (1→3)-β-D-glicanos e certos surfactantes e proteínas. A interferência típica do ensaio LAL é geralmente independente do tempo. 

Como a baixa recuperação de endotoxinas e a interferência típica do ensaio LAL podem ser detectadas?

As abordagens para identificar a baixa recuperação de endotoxinas e a interferência típica do ensaio LAL também diferem. A baixa recuperação de endotoxina é detectada usando estudos de tempo de retenção, nos quais uma quantidade conhecida de endotoxina é adicionada a uma droga, e sua recuperação é determinada após períodos de tempo predefinidos. A baixa recuperação de endotoxinas é observada quando a recuperação diminui significativamente ao longo do tempo. 

A interferência típica do ensaio LAL pode ser detectada usando controles positivos e negativos e estudos de pico, nos quais uma quantidade predeterminada de endotoxina é adicionada a uma amostra e sua recuperação imediata é examinada. A interferência do ensaio LAL é observada quando a recuperação imediata da endotoxina está fora de um intervalo aceitável. 

Como a baixa recuperação de endotoxinas e a interferência típica do ensaio LAL podem ser superadas?

Para superar a baixa recuperação de endotoxinas, agentes de desmascaramento e protocolos (com o objetivo de interromper as interações entre a endotoxina e a matriz do produto), fontes alternativas de endotoxinas e testes alternativos de pirogênio podem ser considerados [2]. Se uma amostra enriquecida estiver exibindo baixa recuperação de endotoxina, o desmascaramento também pode ser obtido diluindo a amostra em Água de Reagente de Lisado e testando-a após 24 horas (em vez de precisar de um tampão de desmascaramento). Além disso, o pH mais baixo mitiga a baixa recuperação de endotoxinas, de modo que o pH pode ser reduzido durante o estudo de tempo de retenção e, em seguida, um reagente de teste de endotoxina auto-tamponante pode ser usado. 

A interferência típica do ensaio LAL pode ser resolvida com a ajuda da diluição, ajustando o pH da reação LAL à sua faixa ideal, aquecimento e certos agentes bloqueadores [3]. 

No geral, tanto a baixa recuperação de endotoxinas quanto a interferência típica do ensaio LAL podem levar a resultados falso-negativos do teste de endotoxinas, mas seus mecanismos e as abordagens para sua detecção e eliminação diferem. Devido aos riscos associados aos resultados dos testes de endotoxinas falso-negativos, a conscientização sobre a baixa recuperação de endotoxinas e a interferência do ensaio LAL é crítica.

Referências

1. von Wintzingerode F. (2016). Low endotoxin recovery, a brief overview. American Pharmaceutical Review. https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/239898-Low-Endotoxin-Recovery-A-Brief-Overview/
2. Reich J, Weyer FA, Tamura H, Nagaoka I & Motschmann H. (2019). Low endotoxin recovery-masking of naturally occurring endotoxin. International Journal of Molecular Sciences, 20(4): 838. doi:10.3390/ijms20040838
3. Sandle T. (2021). Bacterial Endotoxin Test using LAL methodology: overcoming interfering factors. European Pharmaceutical Review. https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/161082/bacterial-endotoxin-test-using-lal-methodology-overcoming-interfering-factors/