Como os reagentes LAL recombinantes diferem uns dos outros?

Os reagentes recombinantes comercialmente disponíveis agora vêm em dois tipos: Fator C Recombinante (rFC) e Reagente em Cascata Recombinante (rCR). As monografias da Farmacopeia Americana, Japonesa e Europeia aceitam os métodos rFC e rCR como alternativas de LAL, mas o teste de adequação baseado na aplicação ainda é necessário. 

Os produtos farmacêuticos, incluindo vacinas, podem ser contaminados por endotoxinas, que são lipopolissacarídeos de bactérias Gram-negativas estáveis ao calor. As propriedades pirogênicas das endotoxinas requerem testes de endotoxinas para produtos farmacêuticos parenterais a fim de prevenir reações fisiológicas graves em pacientes. Atualmente, o método prevalente para o teste é o ensaio de Lisado de Amoebócitos Limulus (LAL) derivado de animais. No entanto, ensaios utilizando fatores recombinantes, um reagente não derivado de animais, têm sido sugeridos como alternativas [1] e propostos como métodos para aceitação compendial [2].
Os reagentes recombinantes comercialmente disponíveis agora vêm em dois tipos:

• Fator C Recombinante (rFC)
• Reagente em Cascata Recombinante (rCR).

Embora as monografias da Farmacopeia Japonesa, Farmacopeia dos EUA e Farmacopeia Europeia aceitem os métodos rFC e rCR como alternativas de LAL, o teste de adequação baseado na aplicação ainda é necessário [2]. 

Fator C Recombinante (rFC)

A Farmacopeia Europeia e a Farmacopeia dos Estados Unidos reconhecem os ensaios de rFC como um método oficial. Os reagentes do Fator C recombinante (rFC) consistem apenas no componente do Fator C recombinante da cascata de coagulação. Este teste usa um método fluorométrico de ponto final [2]. Os métodos descritos em Ph.Eur 2.6.32 e USP <86> para rFC é a descrição para este método fluorescente de ponto final. 

Reagente em Cascata Recombinante (rCR) 

A Farmacopia dos EUA reconhece o rCR como um método oficial. A reação em cascata de três zimogênios de protease e um coagulogênio é a base do mecanismo molecular para a coagulação da hemolinfa por endotoxina. A cascata começa com a ativação do zimogênio (fator C) pela endotoxina. A ativação do fator C desencadeia a ativação do fator B.

O fator B, além de seu papel conhecido na cascata de coagulação (transmissão de sinais do fator C), também se liga à endotoxina. A ativação gradual amplifica os sinais, aumentando a sensibilidade. A atividade da protease do rCR, contendo fator C recombinante, é significativamente maior do que a do fator C recombinante sozinho, demonstrando a amplificação substancial do sinal alcançada através da reação em cascata.
A enzima procoagulante é a terceira enzima adicionada que vem do genoma de Limulus polyphemus.
É adicionado um cromóforo que é ativado pela enzima de coagulação, assim como é separado do reagente LAL cromogênico.
A metodologia de teste rCR é paralela às técnicas quantitativas fotométricas (cromogênicas cinéticas) descritas na USP <85>. A capacidade de executar medições cinéticas permite que sensibilidades mais baixas sejam medidas, equivalentes aos reagentes KCA na USP <85>. As medições cinéticas normalmente permitem uma sensibilidade mais fina e uma faixa de quantificação mais ampla, pois podem acomodar os múltiplos tempos de ativação diferentes de muitas concentrações padrão. 

PYROSTAR™ Neo +: Uma Alternativa Superior Baseada em rCR 

As proteínas recombinantes oferecem um método sustentável e livre de animais para a produção em massa, eliminando preocupações éticas e limitações de escala [3].

Nosso novo reagente PYROSTAR™ Neo+, uma proteína recombinante, usa o Ensaio Cromogênico Cinético (KCA) para detectar níveis de endotoxinas bacterianas gram-negativas. Este reagente é uma solução abrangente para ensaios de LAL, incorporando o Fator C e o Fator B recombinantes, a enzima procoagulante (componentes essenciais de LAL), um substrato cromogênico e uma solução tampão adequada. Um substrato cromogênico permite a medição quantitativa dos níveis de endotoxina, espelhando o processo do método LAL tradicional e fornecendo um resultado numérico preciso. Além disso, o sistema PYROSTAR Neo+ demonstra uma diminuição na interferência de certos medicamentos e exibe maior sensibilidade a endotoxinas de ocorrência natural, ampliando assim sua aplicabilidade a uma gama mais ampla de amostras e usos, como avaliar a segurança do produto e analisar materiais farmacêuticos e a água usada em sua produção. 

Referências

1. Marius, M., Vacher, F. & Bonnevay, T. (2020). Comparison of LAL and recombinant Factor C endotoxin testing assays in human vaccines with complex matrices. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 74: pdajpst.2019.010389.
2. USP (2025). Capítulo <86> Teste de Endotoxinas Bacterianas usando Reagentes Recombinantes.
3. Kang, D.H., Yun, S.Y., Eum, S., Yoon, K.E., Ryu, S.R., Lee, C., et al. (2024). A Study on the Application of Recombinant Factor C (rFC) Assay Using Biopharmaceuticals. Microorganisms, 12(3): 516.