Compreendendo a diferença entre testes de esterilidade, biocarga, pirogênio e endotoxina bacteriana

Para garantir a segurança do paciente, os medicamentos farmacêuticos parenterais e os dispositivos médicos devem estar livres de contaminação por microrganismos vivos e pirogênios, incluindo endotoxinas. Dessa forma, seus processos de fabricação devem obedecer a rigorosos requisitos regulatórios e de controle de qualidade. Os testes de biocarga, pirogênio e endotoxina são ferramentas importantes para o desenvolvimento e a fabricação de medicamentos e dispositivos médicos parenterais estéreis e livres de pirogênio. Entretanto, há distinções claras entre os conceitos de esterilidade, carga biológica e testes de pirogênio e endotoxina. 

Esterilidade designa um estado no qual todos os microrganismos vivos, incluindo bactérias, vírus e fungos, foram eliminados ou inativados de um produto ou ambiente. Os medicamentos farmacêuticos parenterais e os dispositivos médicos devem ser estéreis (livres de quaisquer microrganismos vivos). Para atingir esse objetivo, eles podem passar por um processo de esterilização (eliminação de microrganismos), que pode envolver autoclavagem, esterilização por calor seco, filtração, irradiação gama ou esterilização por óxido de etileno. Ao esterilizar produtos sensíveis ao calor, precauções devem ser tomadas para evitar danos induzidos pelo calor durante a esterilização. Filtração e ambiente de sala limpa podem ser usados nesses casos. Salas limpas são projetadas para minimizar o risco de contaminação e manter a temperatura, os níveis de partículas e a umidade controlados. 

O teste de incubação de 14 dias é considerado o padrão ouro para testes de esterilidade. No entanto, ele tem limitações, como seu longo prazo de entrega e potenciais falsos positivos para produtos celulares. Métodos alternativos para testes de esterilidade podem ajudar a resolver esses problemas. Notavelmente, uma alternativa de esterilidade de 1 dia seria ideal para muitos produtos que atualmente são lançados “em risco”. 

Em contraste, o conceito de biocarga indica o número de microrganismos viáveis que estão presentes em um produto ou ambiente não estéril antes da esterilização. Avaliar a biocarga de um produto permite que os cientistas analisem a eficácia de uma esterilização subsequente. A esterilização garante que microrganismos viáveis sejam eliminados de um produto ou ambiente. Entretanto, a esterilização pode não ser suficiente para remover pirogênios, incluindo endotoxinas, que são muito resistentes ao calor. 

Pirogênios são moléculas que, se entrarem em contato com a corrente sanguínea de uma pessoa, podem causar febre, inflamação e até choque séptico. Endotoxinas bacterianas, que são lipopolissacarídeos encontrados na membrana externa de bactérias gram-negativas, são pirogênios especialmente fortes. Eles são liberados principalmente por bactérias gram-negativas durante a lise celular e podem levar a reações adversas graves se atingirem a corrente sanguínea. Entretanto, também existem pirogênios não endotoxinas, como peptidoglicanos e ácido lipoteicóico de bactérias gram-positivas, e glicanos e mananos de fungos. 

Devido à alta resistência ao calor dos pirogênios, sua eliminação pode ser muito desafiadora. O processo de eliminação de pirogênios é conhecido como despirogenação e pode envolver procedimentos como esterilização por calor seco, filtração ou inativação química. Para produtos líquidos que não podem ser facilmente despirogenados, a fabricação em um ambiente livre de pirogênios é fundamental. 

Os métodos de teste para identificação de contaminação por pirogênios, incluindo contaminação por endotoxinas bacterianas, devem obedecer às orientações rigorosas das agências reguladoras. 

Alguns métodos de teste detectam pirogênios tanto endotoxinas como não endotoxinas. Historicamente, o Teste de Pirogênio em Coelhos foi introduzido pela primeira vez para testes de pirogênio, mas tem deficiências, incluindo sua variabilidade, sensibilidade limitada e preocupações com o bem-estar animal. Isso levou ao desenvolvimento do teste de ativação de monócitos (MAT). O MAT foi amplamente implementado para a detecção de pirogênios tanto endotoxinas como não endotoxinas devido ao seu formato in vitro conveniente e alta sensibilidade e especificidade. A FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation desenvolveu um reagente para testes de peptidoglicano, que pode ser usado como uma solução para algumas necessidades de testes de pirogênios, bem como o LumiMAT™, que é um MAT rápido e simples. 

Testes específicos para testes de endotoxina bacteriana, como o ensaio de Lisado de Amebócito Limulus (LAL), têm sido a alternativa histórica aos testes de pirogênio, pois a endotoxina é o pirogênio mais potente e o mais resiliente à inativação. Para testes de endotoxina bacteriana, o ensaio LAL foi estabelecido como o padrão ouro devido à sua alta precisão, sensibilidade e especificidade. Pode ser conduzido tanto como um ensaio de gel-coágulo semiquantitativo quanto como um ensaio turbidimétrico ou colorimétrico quantitativo. Além disso, como o ensaio LAL tradicional usa lisado derivado dos amebócitos do caranguejo-ferradura Limulus, alternativas sintéticas para testes de endotoxina foram estabelecidas. A FUJIFILM Wako desenvolveu uma linha de reagentes LAL sensíveis e específicos e uma alternativa sintética rCR, que agora é um método compendial nos Estados Unidos. 

Os medicamentos farmacêuticos parenterais e os dispositivos médicos devem ser estéreis e livres de pirogênios. O uso apropriado de testes de biocarga, pirogênio e endotoxina desempenha um papel importante para atingir esse objetivo.