Estratégias para medir endotoxina em amostras difíceis

A contaminação por endotoxinas de produtos terapêuticos parenterais pode levar a consequências graves, incluindo febre, sepse e choque séptico. Dessa forma, o teste de endotoxina foi estabelecido como um componente rotineiro e crítico da fabricação e controle de qualidade de produtos farmacêuticos parenterais e dispositivos médicos.

O ensaio de lisado de amebócito Limulus (LAL) é o teste melhor estabelecido para avaliação de endotoxinas.1 Ele depende da incubação de um extrato de amebócitos do caranguejo-ferradura com uma amostra examinada para contaminação por endotoxinas. Se a endotoxina estiver presente na amostra analisada, um coágulo é formado. A técnica de ensaio LAL mais tradicional é o ensaio qualitativo de gel-coágulo. Posteriormente, foram desenvolvidas versões quantitativas do ensaio LAL, incluindo os ensaios LAL cromogênico e turbidimétrico.

A precisão e a confiabilidade do ensaio LAL foram confirmadas. No entanto, uma variedade de fatores relacionados aos produtos testados, componentes da mistura de ensaio, meio ambiente e até recipientes podem causar desafios de teste e resultados enganosos, incluindo interferência de amostra ou mascaramento de endotoxinas.2–4 Fatores que podem interferir no desempenho apropriado do ensaio LAL incluem inibidores químicos (como ácido etilenodiaminotetracético, EDTA); agentes desnaturantes (como ácidos concentrados, bases, sais inorgânicos ou solventes orgânicos); moléculas de álcool base; um valor de pH fora da faixa ideal; mascaramento de endotoxinas (por substâncias como excipientes, surfactantes, quelantes ou óxido de N-dimetilamina); ou absorção da endotoxina para superfícies de recipientes.1 Para dispositivos médicos, o revestimento anticoagulante, o teor de metais pesados ou a presença de partículas podem interferir nos resultados do teste.2 Para produtos avaliados com o método cromogênico, os componentes da mistura de ensaio que viram uma cor específica quando entram em contato com o reagente LAL também podem interferir nos resultados do teste.1 Para amostras examinadas com o método turbidimétrico, produtos turvos ou suspensos também podem levar à interferência da amostra.1 

Várias estratégias foram desenvolvidas para mitigar a influência de fatores que causam interferência na amostra ou mascaramento de endotoxinas:

  1. Diluição apropriada da amostra – Se não houver atividade interferente ou intensificadora no ensaio LAL, recomenda-se a triagem de produtos não diluídos. No entanto, se os ingredientes do produto interferirem com o ensaio LAL, o produto deve ser diluído para superar a interferência ou intensificação. Recomenda-se identificar a menor diluição do produto que neutralizaria o efeito interferente, mas ainda assim permitiria a determinação de endotoxinas.2
  2. Digestão, adição de tampão, filtração ou centrifugação são outros tratamentos potenciais para a mitigação da interferência de teste para dispositivos médicos.2 Sua implementação deve ser baseada em uma avaliação cuidadosa dos fatores de interferência e validação das condições de teste.
  3. Manutenção de uma faixa de pH ideal  – A faixa de pH ideal para o ensaio LAL está na faixa de 6,0-8,0, e as condições de teste devem ser mantidas dentro dessa faixa para garantir resultados consistentes.
  4. Garantia da homogeneidade da amostra – Suspensão em amostras podem causar problemas de interferência. Portanto, um esforço deve ser feito para garantir a homogeneidade da amostra. Neste contexto, não é recomendado agrupar amostras de diferentes etapas do processo de fabricação, uma vez que sua homogeneidade pode ser difícil de ser garantida.2
  5. Ajuste da diluição máxima válida (MVD) para amostras agrupadas – Em certos casos, unidades de pequeno volume de produto farmacêutico acabado podem ser agrupadas em uma amostra composta para uma análise de ensaio LAL. Nesses casos, a MVD deve ser ajustada para um valor proporcionalmente menor dividindo a MVD calculada para uma amostra individual pelo número total de amostras agrupadas.2
  6. Uso de kits e recipientes de amostra bem caracterizados por seu desempenho no ensaio LAL – Como os componentes da mistura de ensaio LAL e recipientes de amostra também podem afetar negativamente os resultados do teste,4 apenas kits de teste e recipientes de amostra bem caracterizados devem ser usados.

 

Fontes de literatura

  1. Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.
  2. FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. Junho 2012.
  3. Reich J, Lang P, Grallert H, Motschmann H. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems. Biologicals. 2016;44(5):417-22. doi: 10.1016/j.biologicals.2016.04.012.
  4. Bech Ørving R, Carpenter B, Roth S, Reich J, Kallipolitis B, Sonne-Hansen J. Bacterial Endotoxin Testing-Fast Endotoxin Masking Kinetics in the Presence of Lauryldimethylamine Oxide. Microorganisms. 2020;8(11):1728. doi: 10.3390/microorganisms8111728.