Extração e quantificação de endotoxinas bacterianas

As endotoxinas são moléculas lipopolissacarídicas encontradas na membrana externa das bactérias gram-negativas. As endotoxinas que entram no corpo humano podem causar uma reação inflamatória perigosa. Por esse motivo, as diretrizes da FDA impõem limites estritos aos níveis de endotoxinas em extratos de dispositivos médicos. Os dispositivos que entram em contato com o sistema cardiovascular ou linfático devem ficar abaixo de 0,5 UE/ml, enquanto que aqueles que entram em contato com o líquido cefalorraquidiano devem ficar abaixo de 0,6 UE/ml.

O teste de lisado de Amebócito Límulus (LAL) é o método mais popular para testar os níveis de endotoxina. Esse método usa o lisado de amebócito do caranguejo ferradura do Atlântico, no qual a presença de endotoxinas desencadeia um mecanismo de defesa que induz a coagulação. O teste LAL é comumente usado em muitos setores, como medicamentos, dispositivos médicos, hospitais e laboratórios de pesquisa.

A solução de amostra usada com os testes LAL pode ter um impacto considerável na eficiência da reação de endotoxina. Geralmente, as soluções de amostra são preparadas em água. No entanto, estudos determinaram que pode haver outras substâncias presentes nessas soluções que podem interferir na reação de coagulação de LAL. Fontes comuns de interferência incluem metais, aminoácidos, antibióticos e enzimas.

A solução de extração de endotoxinas, fabricada pela FUJIFILM Wako, permite a extração de endotoxinas que não podem ser extraídas em água ou solução salina. A solução é especialmente recomendada para dispositivos médicos que possam entrar em contato com fluidos contendo sangue ou proteínas. Um kit inclui quatro frascos de 10 ml.

A solução de extração é simples e fácil de usar: dilua um único frasco do produto 1:20 em água sem endotoxinas e adicione-o à amostra ou mergulhe a amostra nela. Após agitação suave e uma hora de incubação à temperatura ambiente, a endotoxina extraída pode ser medida.

Após a extração, Limulus Color KY Series fornece um método robusto para quantificar os níveis de endotoxina. A presença de endotoxinas desencadeia uma cascata de desenvolvimento de cor em que vários precursores de serina proteases são ativados. Na última reação, a enzima coagulante hidrolisa o substrato cromogênico para liberar o cromógeno amarelo.

O kit depende do teste cinético cromogênico, que supervisiona o tempo de absorção para chegar a um valor limite, conhecido como tempo de ativação (Ta). Medir o Ta de amostras de endotoxinas conhecidas nos permite preparar a curva padrão que determina, a partir do Ta, a concentração de endotoxinas de uma amostra desconhecida.

O kit Limulus Color KY é muito sensível, com um limite de detecção quantitativa de 0,0002 UE/ml (tipo único) ou 0,0005 UE/ml (tipo múltiplo). Além disso, como se sabe que um fungo polissacarídeo conhecido como (1→3)-β-D-glicano ativa o LAL, o reagente contém um alto nível de (1→3)-β-D-glicano e, portanto, seus efeitos são inibidos. Isto permite que as endotoxinas sejam detectadas com alta especificidade, evitando falsos positivos.

O kit Limulus Color KY é compatível com o formato do leitor de tubos Toxinometer® ou com um leitor de microplacas. Está disponível como kit de teste único ou teste múltiplo e pode ser adquirido com o controle padrão de endotoxinas (CPE). O CPE contém endotoxinas purificadas liofilizadas da cepa UKT-B de E. coli e pode ser usado como um padrão para ensaios de LAL.

ALGUNS ACESSÓRIOS LAL:

Frasco de Água Reagente para LAL	Pontas de Pipette isentas de Endotoxinas	Wako Bioclean Plates