Fontes laboratoriais comuns de endotoxina e estratégias para sua detecção e remoção

As endotoxinas bacterianas, que são fortes pirogênios ubiquamente presentes no meio ambiente, também representam uma grande causa de preocupação como contaminantes de laboratório. Se as endotoxinas permanecerem não detectadas após a contaminação de amostras, materiais ou equipamentos de laboratório, elas levarão a resultados experimentais não confiáveis e enganosos. Além disso, se os produtos injetáveis forem contaminados com endotoxinas, podem causar uma resposta pirogênica severa nos receptores.¹

Como surge a contaminação por endotoxinas no laboratório?

As endotoxinas bacterianas são constituintes da membrana externa de bactérias gram-negativas e são liberadas em pequenas quantidades durante o ciclo de vida das bactérias e em grandes quantidades após sua morte. Estima-se que uma única bactéria E. coli pode conter até 2 milhões de moléculas de endotoxina.² As endotoxinas podem contaminar laboratórios por diferentes vias, incluindo água, ar ou pele humana contaminados.³ A contaminação por endotoxina pode se espalhar para materiais de plástico ou de vidro de laboratório, bem como para reagentes e soluções de laboratório amplamente utilizados, incluindo meios de cultura de células, soro fetal bovino, fatores de crescimento recombinantes e reagentes de dissociação.

Por que a contaminação por endotoxina no laboratório é perigosa?

A contaminação por endotoxinas de culturas de células ou amostras experimentais levaria a resultados experimentais variáveis e enganosos. A atividade pirogênica das endotoxinas pode mascarar as propriedades inerentes das células, estimulando a liberação de fatores teciduais. Além disso, as endotoxinas provocam uma resposta inflamatória e pirogênica in vivo. É por isso que a contaminação por endotoxinas de produtos injetáveis pode provocar uma reação grave e potencialmente fatal nos receptores.

Teste de contaminação por endotoxina em ambientes de laboratório

Existem vários métodos diferentes para a detecção de endotoxinas, entre os quais o teste do lisado de amebócitos Limulus (LAL) é o mais amplamente estabelecido. Ele se baseia na incubação de uma amostra contendo endotoxina com proteína extraída do sangue do caranguejo-ferradura, levando a uma reação de coagulação que indica a presença de endotoxina.⁴ Dependendo dos parâmetros do teste LAL, a detecção de endotoxina pode ser qualitativa ou quantitativa, enquanto sua visualização pode ser turbidimétrica ou colorimétrica.

Estratégias para remoção de contaminação por endotoxina

As endotoxinas são resistentes ao calor, o que dificulta sua remoção. Medidas preventivas, incluindo o uso de vidraria despirogenada, plástico não pirogênico e água de alta pureza para experimentos de laboratório, ajudariam a evitar a contaminação por endotoxinas e a garantir a aquisição de dados experimentais confiáveis.

Descarte de materiais contaminados com endotoxina

A remoção da contaminação por endotoxina é difícil e, se a contaminação residual permanecer, pode ter sérias consequências. Assim, se os materiais contaminados com endotoxinas puderem ser prontamente substituídos por novos, seria prudente descartá-los. 

Descontaminação de materiais contaminados com endotoxinas

Devido à resistência ao calor das endotoxinas, os protocolos padrão de autoclavagem ou esterilização seriam insuficientes para a remoção de endotoxinas. No entanto, a exposição ao calor seco em temperaturas mais altas e durante um período de tempo mais longo (como 250°C por 30 min ou a 180°C por 4 h) tem sido usada com sucesso para a remoção de endotoxinas.^4,5 Outros protocolos para descontaminação de endotoxinas incluem o uso de cromatografia de afinidade e soluções baseadas em Triton X-114.^6,7 Como abordagens alternativas, foi proposto um ciclo de lavagens em NaOH, HCl e etanol a 70% ou lavagens em etanol a 70%, que pode ser seguida por uma lavagem em ácido acético.³

Fontes de literatura

1. Li Y, Boraschi D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 2016;11(3):269-87. doi: 10.2217/nnm.15.196. Errata em: Nanomedicine (Lond). 2016;11(6):739.
2. Rhee SH. Lipopolysaccharide: basic biochemistry, intracellular signaling, and physiological impacts in the gut. Intest Res. 2014;12(2):90-5. doi: 10.5217/ir.2014.12.2.90.
3. Gorbet MB, Sefton MV. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 2005;26(34):6811–6817. doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.04.063.
4. https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/inspection-technical-guides/bacterial-endotoxinspyrogens.
5. Sandle T. A comparative study of different methods for endotoxin destruction. Am Pharm Rev. 2013;Supplement.
6. Schneier M, Razdan S, Miller AM, Briceno ME, Barua S. Current technologies to endotoxin detection and removal for biopharmaceutical purification. Biotechnol Bioeng. 2020;117(8):2588-2609. doi: 10.1002/bit.27362.
7. Teodorowicz M, Perdijk O, Verhoek I, Govers C, Savelkoul HF, Tang Y, Wichers H, Broersen K. Optimized Triton X-114 assisted lipopolysaccharide (LPS) removal method reveals the immunomodulatory effect of food proteins. PLoS One. 2017;12(3):e0173778. doi: 10.1371/journal.pone.0173778