Transição do teste Gel-coágulo para o Cinético

O significado do teste de endotoxina

As endotoxinas estão ubiquamente presentes no ambiente e são liberadas principalmente da membrana externa de bactérias gram-negativas durante a lise bacteriana. Se as endotoxinas bacterianas obtiverem acesso parenteral ao organismo humano, elas podem causar inflamação, choque séptico, hemorragia e até morte.¹ Além disso, em aplicações de pesquisa, a contaminação por endotoxinas leva a resultados não confiáveis e possivelmente interpretações enganosas. Portanto, o teste de endotoxinas tornou-se parte integrante do desenvolvimento e controle de qualidade de produtos farmacêuticos injetáveis e de dispositivos médicos. 

O ensaio de lisado de amebócitos Limulus (LAL) como o teste de endotoxina melhor estabelecido

Vários métodos para testes de endotoxinas foram desenvolvidos. Entre eles, o ensaio LAL foi estabelecido como o teste padrão-ouro para a determinação de endotoxinas.^2,3 O ensaio LAL baseia-se na incubação de proteínas extraídas do sangue de caranguejos ferradura com uma amostra analisada quanto ao teor de endotoxinas. Se a amostra investigada contém endotoxina, as enzimas pró-coagulantes no LAL interagem com ela, levando à ativação da cascata de coagulação, modificação do coagulogênio de amebócitos e formação de um coágulo de gel.  Isso é conhecido como o método ou técnica gel-coágulo.  O coágulo de gel formado é visualizado e avaliado qualitativamente.  Embora a técnica gel-coágulo seja sensível e fácil de usar, ela não permite a quantificação de endotoxinas e a análise de alto rendimento. Portanto, ensaios quantitativos de LAL também foram desenvolvidos.

O desenvolvimento e as vantagens dos ensaios cinéticos LAL

Os ensaios cinéticos LAL têm vantagens significativas, porque podem quantificar o teor de endotoxinas em uma ampla gama de concentrações e permitir análises automatizadas, reduzindo as variações de ensaio relacionadas ao usuário.A quantificação de endotoxina pode ser realizada avaliando a turbidez (um ensaio LAL turbidimétrico) ou alterações na cor da mistura de reação (um ensaio LAL cromogênico).  Tanto os ensaios LAL turbidimétricos quanto cromogênicos podem ser usados como ensaios cinéticos e de ponto final.

Ensaio LAL turbidimétrico quantitativo

O ensaio turbidimétrico LAL quantitativo avalia a formação de turbidez (nebulosidade) que ocorre após a clivagem do substrato enzimático e antes da formação do gel. A turbidez é quantificada usando um espectrofotômetro ou um leitor de microplacas. O ensaio turbidimétrico quantitativo LAL é confiável, sensível e compatível com análise de alto rendimento.

Ensaio LAL cromogênico quantitativo

O ensaio LAL cromogênico depende da clivagem de um substrato cromogênico, o que leva à liberação de cromogênio. A reação colorimétrica é então visualizada e quantificada fotometricamente. O ensaio cromogênico quantitativo LAL é altamente sensível e permite medições de endotoxina automatizadas e análises de alto rendimento.

Ensaios baseados em fator C recombinante

Ensaios baseados em fator C recombinante para determinação quantitativa de endotoxina também foram desenvolvidos. São empregados fator C recombinante, que é o componente inicial da cascata de coagulação do caranguejo ferradura, induzida por endotoxinas.⁴ 

Considerações para a transição para o teste LAL cinético

O ensaio LAL foi amplamente aceito como o teste padrão para a determinação de endotoxinas.^2,3 Mesmo que todas as variações do ensaio LAL sejam sensíveis e confiáveis, os ensaios quantitativos LAL e os ensaios baseados em fator C recombinante estão ganhando popularidade devido à sua capacidade de fornecer determinação quantitativa e de alto rendimento de endotoxinas. Uma série de fatores deve ser considerada ao selecionar o ensaio quantitativo mais apropriado para a determinação de endotoxinas,⁵ , incluindo a natureza e característica das amostras analisadas, o equipamento disponível e possivelmente os requisitos regulamentares relevantes.

Fontes de literatura

1. Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources 2018;52:115–120. https://doi.org/10.1016/j.anres.2018.08.002.
2. Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.
3. Mehmood, Y. What Is Limulus amebocyte lysate (LAL) and its applicability in endotoxin quantification of pharma products. Growing and Handling of Bacterial Cultures. IntechOpen 2019. Doi: 10.5772/intechopen.81331.
4. Suvarna, K. Endotoxin detection methods – Where are we now?American Pharmaceutical Review. 2015, August 25.
5. Wong J, Davies N, Jeraj H, Vilar E, Viljoen A, Farrington K. A comparative study of blood endotoxin detection in haemodialysis patients. Journal of Inflammation (London) 2016;13:24. doi: 10.1186/s12950-016-0132-5.