Visão Geral dos Regulamentos Por Diferentes Farmacopeias e os Esforços de Harmonização Para A Nova Geração de Testes de Pirogênio E Endotoxina (rFC, rCR e MAT)

Os avanços científicos nas últimas décadas facilitaram a transição para novas tecnologias livres de animais. O MAT, rFC e rCR representam metodologias de ponta em testes de pirogênios de última geração. A Farmacopeia dos EUA incluiu o uso de rCR, rFC e MAT em suas diretrizes. Entretanto, a Farmacopeia Europeia incluiu apenas o MAT e rFC em suas diretrizes. 

A detecção de pirogênios é uma medida de segurança vital na fabricação de produtos farmacêuticos injetáveis. Esses contaminantes, categorizados como endotoxinas e encontrados na membrana externa da parede celular de bactérias gram-negativas, podem causar febre grave ou choque tóxico se administrados por via intravenosa. É importante ressaltar que os pirogênios que não são endotoxinas também representam uma ameaça significativa, comparável à das endotoxinas. 

Da década de 1940 à década de 1970, a indústria farmacêutica dependia de coelhos para detectar endotoxinas, levando à morte de um grande número de animais. [1] 

No entanto, na década de 1970, surgiu uma nova abordagem para a detecção de endotoxinas, utilizando a hemolinfa de caranguejos-ferradura. O teste de Lisado de Amebócitos Limulus (LAL) é baseado na interação entre amebócitos e contaminantes bacterianos. Este método é amplamente reconhecido como o padrão internacional para detecção de endotoxinas. Nos últimos anos, a demanda por metodologias de testes sustentáveis tem sido uma tendência crescente em todos os campos científicos.

A FUJIFILM aumentou significativamente a sua dedicação à proteção destes animais notáveis através de colaborações com vários outros grupos e organizações de conservação ecológica. Isso engloba o apoio ao Fundo de Conservação do Caranguejo-Ferradura, que se dedica à preservação a longo prazo desses caranguejos por meio de iniciativas comunitárias e divulgação educacional. 

Fator C Recombinante (rFC) e Reagente em Cascata Recombinante (rCR) 

O genoma do caranguejo-ferradura foi recentemente usado para desenvolver proteínas recombinantes a partir da cascata natural de LAL, que são componentes-chave em reagentes rFC e rCR (por exemplo, PYROSTAR™ Neo+). Ao contrário dos reagentes LAL de origem natural, esses reagentes alternativos oferecem vantagens, como evitar a variabilidade lote a lote e minimizar falsos positivos da via de coagulação de (1→3)-β-D-glicano. Além disso, o uso de reagentes recombinantes promove testes sustentáveis de endotoxinas, alinhando-se com os princípios de substituição, redução e refinamento para o bem-estar animal. [4] 

Em setembro de 2019, o Comitê de Especialistas em Microbiologia da USP propôs edições ao capítulo <85> do teste harmonizado de endotoxinas bacterianas USP-NF, que incluía a adição de reagentes LAL recombinantes ao capítulo; no entanto, essa proposta foi rejeitada. Outras propostas falharam, como a adição de um capítulo consultivo, <1085.1>, deixando reagentes LAL recombinantes (rLAL) como métodos alternativos. Em 2022, o Comitê de Expectativas em Microbiologia da USP foi dissolvido, com uma nova comissão escolhida que se reuniu novamente em 2023. Com a chegada de um novo comitê de especialistas em 2023, a FUJIFILM Wako lançou o pacote de validação interna PYROSTARTM Neo+ para auxiliar na validação do método. Mais tarde naquele ano, o capítulo <86>, que inclui reagentes rFC e rCR, foi elaborado pelo comitê da USP. A USP votou em julho de 2024 para incluir a USP <86> na publicação de 2025 após um período de consulta pública. Em maio de 2025, o capítulo <86> foi oficialmente incluído na USP-NF 2025 Edição 1. [5] 

Em relação à implementação de reagentes em cascata recombinantes (rCR), é importante notar que a seção 2.6.32 da Farmacopeia Europeia, que lista os reagentes rFC como um método compendial para BET, não aborda especificamente ou fornece orientação sobre o uso de reagentes rCR. Como resultado, na Europa, o método rCR é visto como uma alternativa não farmacopeica. [6] 

Teste de Ativação de Monócitos (MAT) 

As células humanas são usadas no MAT, o que permite maior relevância fisiológica. Além disso, enquanto o LAL testa apenas a contaminação por endotoxinas, o MAT também detecta a contaminação por pirogênios não endotoxínicos (NEPs). [7] A maioria dos kits MAT disponíveis comercialmente usa Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) para um ELISA para realizar o teste. Variações entre lotes de PBMC são comuns, e o tempo médio de resposta do teste é de dois dias devido à necessidade de cultura de células, ELISA e múltiplas etapas de pipetagem e lavagem. 

Em contraste, o Kit de Detecção de Pirogênio LumiMAT™ da FUJIFILM detecta pirogênios usando um novo ensaio de gene repórter NF-κB. O ensaio do gene repórter NF-κB oferece várias vantagens, incluindo ausência de ELISA, facilidade de manuseio e tempo de reação significativamente reduzido devido à eliminação da necessidade de esperar pela liberação de IL-6. O LumiMAT™ pode fornecer resultados precisos em menos da metade do tempo dos kits MAT tradicionais, utilizando uma leitura de luminescência em vez da metodologia ELISA tradicional. 

A Direção Europeia para a Qualidade dos Medicamentos & Cuidados de Saúde, o Conselho da Europa e a Parceria Europeia para Abordagens Alternativas à Testagem em Animais colaboraram na conferência internacional "O futuro dos testes de pirogenicidade: a eliminação gradual do teste de pirogênio em coelhos". O objetivo da conferência era apresentar a estratégia da Farmacopeia Europeia para remover o RPT de seus textos até 2026, agilizar a implementação do MAT e identificar deficiências na erradicação do RPT. [8] 

A FDA reconheceu o uso potencial do MAT após a validação específica do produto em 2009, publicando posteriormente diretrizes em 2009 e 2012 que incluíam seu possível uso para produtos regulamentados pelo FDA, como dispositivos médicos, mediante validação. O Capítulo Geral sobre Pirogênios da Farmacopeia dos EUA permite a substituição de um teste de pirogênio ou endotoxina bacteriana validado in vitro pelo teste de pirogênio em coelho (RPT), conforme USP 2018. [9] 

O processo de validação deve incluir diferentes testes, como triagem de interferência e testes de adequação do método, além de garantir que as qualificações do analista e do laboratório sejam validadas para o ensaio. [10] 

Referências:

1. HealthCare, E.D.f.t.Q.o.M., Ph. Eur. bids adieu to rabbit pyrogen test in its monographs. 2024.
2. Levin, J. and F.B. Bang, Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb Diath Haemorrh, 1968. 19(1): p. 186-97.
3. Farmacopeia, U., Farmacopeia dos EUA—Formulário Nacional [USP 40 NF 35]. vol. 1. Rockville, Md, Convenção Farmacopeica dos Estados Unidos. 2017, Inc.
4. Kelley, M., et al., A Demonstration of the Validation Process for Alternative Endotoxin Testing Methods Using PyroSmart NextGen® Recombinant Cascade Reagent. BPB Reports, 2023. 6: p. 68-75.
5. Rockville, USP provides guidelines for Recombinant Factor C (rFC) a non-animal-derived reagent critical to development of vaccines and other sterile pharmaceutical products. usp, 2020.
6. Carmen Marín Delgado de Robles (Roche Basel-Kaiseraugst), D.L.S.G., Evelyn Der (Genentech), Endotoxin testing: the international regulatory landscape. European Pharmaceutical Review, 2024.
7. Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.
8. Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p. 101702.
9. Allen, D., et al. Using the Monocyte Activation Test for medical devices. in NICEATM poster: SOT 2019 Annual Meeting. 2019.
10. Sandle, T., Orientação da FDA sobre testes de pirogênios e endotoxinas.