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Eliminação e seguimento de endotoxinas bacterianas de amostras biológicas

23rd June 2016

Eliminação e seguimento de endotoxinas bacterianas de amostras biológicasA eliminação de endotoxinas bacterianas de amostrar biológicas é uma prática de rotina em muitos laboratórios de investigação. As bactérias Gram negativas, donde provêm as endotoxinas bacterianas, são caracterizadas pela sua possibilidade de crescimento em quase todas as condições e tipos de amostras, nas quais se realizam os ensaios nos laboratórios. Desde que se conhece a pirogenicidade das endotoxinas bacterianas e as consequências para a saúde dos humanos e animais à exposição das mesmas, têm sido estudados os diferentes métodos de separação das mesmas, quando se encontram a contaminar alguma amostra nos laboratórios.

O método mais comum para remover as endotoxinas das dissoluções de fármacos parentéricos é a filtração. As endotoxinas bacterianas são lipopolissacarídeos que são encontrados em diferentes tipos de estados de agregação como contaminantes: em forma de vesículas, de micelas ou do tipo detergente, solúveis. Todas estas formas, que podem estar associadas às moléculas de lipopolissacarídeos, conseguem ser eliminadas usando filtros com diferentes tamanhos de poros. Quando é o caso em que o soluto e os agregados de endotoxinas têm um tamanho semelhante, as interações supramoleculares entre as moléculas de lipopolissacarídeos podem ser vencidas usando métodos como a extração de catiões. Foi demonstrado que os catiões estabilizam as bicamadas formadas pelas moléculas de endotoxinas, em que a parte hidrofílica fica exposta ao meio e as cadeias hidrofóbicas na parte interior da micela ou vesícula. Estes agregados são estabilizados por catiões divalentes, como podem os catiões cálcio ou magnésio presentes em dissoluções aquosas. Ao extrair os catiões das dissoluções podem-se eliminar as endotoxinas usando filtros que tenham um tamanho de poro, que permita passar o soluto e impeça a passagem de endotoxinas contaminantes.

Um método útil para remover endotoxinas de amostras biológicas é a cromatografia de afinidade, que é utilizada habitualmente para amostrar de proteínas. Esta técnica consiste em fazer passar as dissoluções por um material adsorvente poroso com histidina imobilizada, ou também se pode imobilizar a polimixina B. As endotoxinas têm uma grande afinidade pela histidina numa ampla escala de pH e temperatura. Têm sido reportados casos onde, usando este método cromatográfico, é conseguido reduzir a concentração de endotoxinas derivadas de vários tipos de bactérias Gram negativas de 1000 a menos de 0.01 ng/mL de dissolução aquosa. Este tipo de separação pode ser levada a cabo, por exemplo, em amostras que contêm fator de necrose tumoral e lisozimas, com bons resultados. Outros autores compararam os métodos cromatográficos para extrair as endotoxinas de amostras que contêm proteínas com a separação por fases com o detergente Triton X-114. Através deste procedimento é conseguida uma maior recuperação das endotoxinas na fase que contém o detergente do que com a cromatografia de afinidade. Esta técnica resulta de maior utilidade em processos em grande escala, como a purificação de proteínas recombinantes.

Uma substância biológica que tem chamado a atenção dos investigadores para substituir os polímeros sintéticos nos plásticos por uma molécula que permita obter materiais biodegradáveis e/ou biocompatíveis é o poli(3-hidroxibutirato) ou PHB. O PHB é produzido pelas bactérias Gram negativas, entre as quais se podem mencionar a Ralstonia eutropha, a Alcaligenes latus, e a Escherichia coli. recombinante. Em qualquer um dos procedimentos que se seguem para isolar o PHB sintetizado pelas bactérias, as amostras obtidas estão contaminadas com endotoxinas. Para reduzir a quantidade de endotoxinas nas extrações, o método de extração com clorofórmio é substituído pela digestão com hidróxido de sódio. Neste caso concreto a separação das endotoxinas é indispensável para se poder usar PHB em qualquer aplicação biomédica, como por exemplo o desenho de revestimentos para a libertação controlada de fármacos, a fabricação de fios de suturas e a substituição de tecido ósseo.

Em todos os casos onde é necessário separar as endotoxinas de um meio específico, os investigadores realizam o ensaio de LAL como método de seguimento da separação. O ensaio de LAL, o Lisado de Amebócitos de Limulus, baseia-se na gelificação que ocorre na hemolinfa do caranguejo-ferradura na presença de endotoxinas bacterianas. O processo de gelificação pode ser medido qualitativa e quantitativamente por turbidimetria, pois o gel provoca o aparecimento de turbidez no meio. A empresa Wako, através da marca PYROSTAR™, fornece uma série de reagentes e acessórios para realizar o ensaio de LAL.

Estes Kits podem ser adquiridos como provas únicas ou como múltiplas provas, de acordo com a necessidade dos investigadores. Por exemplo, o ensaio simples de Limulus PS é uma prova única onde, mediante a absorção das endotoxinas em Pyrosep™, resina com afinidade e seletividade por este tipo de substâncias, se pode medir o conteúdo das mesmas numa amostra. A diferença de outros Kits para a análise de LAL (Lisado de Amebócitos de Limulus) com o Limulus PS, é que se podem dissolver as amostras não solúveis em água em dissolventes orgânicos para realizar o ensaio. Esta característica é uma vantagem do produto pois principalmente em investigações de fármacos, em muitas ocasiões existe a necessidade de conhecer a presença de endotoxinas em dissoluções não aquosas do analito, por serem moléculas insolúveis na água. Um exemplo onde é útil o ensaio de Limulus PS é em amostras de proteínas lipossolúveis.

Bibliografia:

1) K J Sweadner, M Forte and L L Nelsen, Appl. Environ. Microbiol. October 1977 vol. 34 no. 4 382-385.

2) Matsumae, H., et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, Volume 12, Issue 2, pages 129–140, (1990).

3) Shigui Liu, Rowel Tobias, Shannon McClure, Garth Styba, Qinwei Shi, George Jackowski, Clinical Biochemistry, 30, 6, 455-463, 1997.

4) Sang Yup Lee1, Jong-il Choi1, Kyuboem Han, Ji Yong Song, Appl. Environ. Microbiol., 65, 6, 2762-2764, (1999).

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Por: Lisa Komski Em: Kit LAL