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Estes métodos detectam as endotoxinas bacterianas

3rd June 2014

Estes métodos detectam as endotoxinas bacterianasNa preparação de produtos farmacêuticos e de biotecnologia deve-se garantir que não haja contaminação com pirogênios.

Obviamente, é necessário que exista um controle desse importante indicador para ambas as matérias-primas a serem utilizadas, durante a realização das diferentes etapas do processo de produção e também no produto acabado.

Consequência das endotoxinas bacterianas

A presença destas endotoxinas bacterianas, principalmente os lipopolissacarídeos (LPS) como resultado do metabolismo das bactérias Gram-negativas, que podem resultar em manifestações febris em concentrações de 1-10 ng / kg de endotoxinas, e em alguns casos, até mesmo levar ao choque e, finalmente, à morte. Há uma variedade de pirogênios encontrados, entre eles o ácido lipoteicóico; peptidoglicano; endotoxinas e alguns vírus, fungos, esteroides e enterotoxinas.

O método de detecção

O método utilizado por mais de 40 anos para detectar a presença de pirogênios foi avaliar a resposta febril em coelhos, que se manteve inalterada, sem modificações transcendentes e sua eficácia raramente foi contestada. Hoje, para a aprovação e comercialização de muitos dos produtos farmacêuticos e de biotecnologia concebidos para serem administrados por via parentérica, as principais instituições reguladoras internacionais exigem o controle dos pirogênios pelo método de lisado de amebócitos de Limulus (LAL), que se mostra prático, com elevada sensibilidade e especificidade, e também rapidez.

E assim, uma das grandes desvantagens do teste de pirogênios em coelhos é que os resultados não estão diretamente relacionados com a presença de endotoxinas bacterianas, mas com qualquer substância que provoque uma resposta febril em coelhos. Mas, inversamente, qualquer droga que tenha influência sobre o centro regulador da temperatura corporal afetaria o resultado da coexistência de endotoxinas que se encontram exclusivamente na membrana externa da parede celular das bactérias Gram-negativas., e que são capazes de suportar um tratamento térmico, como é o caso da esterilização a vapor.

Três métodos fundamentais

Para detectar a presença de endotoxinas há essencialmente três métodos:

• método de gelificação, ou gel clot

• turbidimétrico KIT DE 100 PYROSTAR™ ES-F (5.2 ML)

• cromogênico.

Para todos há apenas um objetivo: detectar a presença de endotoxinas.

Método de Gelificação

De um modo geral, o método de gelificação ou gel clot consiste na reação da hemolinfa do caranguejo ferradura em relação à endotoxina. É um teste muito útil e econômico, sendo muito pouco suscetível à inibição e requerendo um equipamento mais sensível e mais barato. Ele pode ser desenvolvido de forma quantitativa ou semiquantitativa, a forma de um teste-limite.

Método Turbidimétrico

Os métodos turbidimétricos consistem do aumento da turbidez na mistura de reação causada pelo aumento da concentração da coagulina insolúvel, que é monitorada espectrofotometricamente. Procura-se o intervalo em que a linearidade da turvação está relacionada com a concentração de endotoxinas na amostra.

Uma variante baseada no princípio do método turbidimétrico, mas com uma cinética muito utilizada hoje em dia é chamado turbidimétrico cinético, que tem a maior variedade de métodos de detecção entre os conhecidos. Para a sua execução deve-se ter o equipamento necessário, essencialmente,o TOXINÔMETRO ET-6000 SERIES que satisfaz as mais elevadas exigências para este tipo de teste originalmente desenvolvido por Levin & Bang em 1968.

Método Cromogênico

Os métodos cromogênicos envolvem o uso de um substrato cromogênico sintético incolor, composto de uma ligação de um péptideo ligado pela arginina terminal-C a uma molécula envolvida na coagulação e que provoca a liberação da molécula de pNA na cor amarela resultando, portanto, em uma proporcionalidade à concentração de endotoxinas na amostra. Este método é bastante caro devido à necessidade da utilização do substrato cromogênico, o que limita a sua utilização de rotina.

A partir deste método, foram desenvolvidas algumas variantes, tais como o método cromogênico final e o método cromogênico cinético.

Zhang et al. desenvolveram um método com base na obtenção de um anticorpo monoclonal contra o péptideo C do LAL, que é um fragmento de 28 aminoácidos de de coagulogênio gerando um novo microensaio de imunoabsorção para a endotoxina.

Outros estão desenvolvendo novos procedimentos, mas a verdade é que o valor e a validade de LAL continuam intactos.

REAGENTES DE LABORATÓRIO QUÍMICOS

Tubos de ensayo

Controle Padrão de Endotoxina

Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F

Tubos de ensayo Controle Padrão de Endotoxina Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F

Lisa
Por: Lisa Komski Em: Kit LAL