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O Coelho e o Caranguejo-Ferradura

23rd September 2014

O Coelho e o Caranguejo-ferraduraO método de LAL para deteção de endotoxinas foi precedido pelo teste pirogénico em coelho por cerca de 30 anos.

Tendo muita informação sobre os procedimentos e os detalhes do teste de LAL para deteção de endotoxinas já sido fornecida, confirma-se que, em grande parte, o teste pirogénico em coelho foi ultrapassado pela técnica de LAL. Espera-se que com discussões sobre o Teste Pirogénico, neste blog, se consiga comparar e compreender o porquê de LAL ser a modalidade preferida para deteção de endotoxinas.

Primeiro há que discutir a Pirexia. Pirexia, ou febre, define-se como a elevação anormal da temperatura corporal. Pirogéneos são substâncias capazes de induzir pirexia. As endotoxinas são o pirogéneo de maior interesse em consequência dos seus efeitos nefastos para o corpo humano. O teste pirogénico em coelho trata-se, basicamente, de uma técnica em que se inocula um coelho com uma amostra de um produto para determinar a presença ou ausência de pirogéneos. Se um pirogéneo estiver presente na substância a testar, desencadear-se-á a elevação da temperatura corporal do animal para valores superiores aos normais. Os coelhos têm uma resposta térmica semelhante aos humanos no que respeita a endotoxinas e é exatamente por esta razão que se consideram ideais para a deteção de pirogéneos.

A Farmacêutica U.S. providencia um protocolo de administração do teste pirogénico. Uma solução-teste é administrada por via intravenosa no ouvido do animal segundo uma taxa que não deverá exceder os 10 ml/kg durante 10 minutos. Todos os materiais, diluentes e soluções utilizadas deverão estar estéreis e isentas de pirogénicos. Deverão também ser selecionados coelhos saudáveis e maturos que se mantêm em cativeiro, sem qualquer forma de distração ou de excitação, a temperaturas entre os 20 e os 30 graus Celsius. Estes detalhes serão melhor explicitados mais adiante uma vez que existem diversos fatores que podem causar a elevação da temperatura corporal. Um coelho só pode ser sujeito a uma solução-teste a cada 48 horas e com pelo menos 2 semanas de intervalo sempre que se registe uma elevação da sua temperatura corporal superior a 0.6 graus Celsius da basal. A temperatura normal do coelho é medida não mais do que 30 minutos antes do início do teste e esta não deverá exceder os 39.8 graus Celsius. Os coelhos utilizados nos grupos de teste devem apresentar uma variação única de temperatura de apenas 1 grau entre indivíduos. Durante o teste, os coelhos são testados em temperaturas semelhantes às do seu cativeiro com a comida retirada e água opcionalmente disponível. A temperatura deverá ser medida através de exame rectal com o coelho na sua posição de descanso natural. As soluções-teste são injetadas na veia da orelha após prévio aquecimento a 35-39 graus Celsius. As leituras de temperatura deverão ser tiradas em intervalos de 30 minutos durante as próximas 1 a 3 horas com 3 coelhos testados por solução.

VER TAMBÉM: Conheça as diversas aplicações do método LAL

Considera-se um teste negativo quando a elevação da temperatura do coelho não excede os 0.5 graus Celsius e então a solução-teste pode ser considerada isenta de pirogénicos. Uma elevação da temperatura de 0.5 graus ou superior determinará a repetição do teste em 5 mais outros indivíduos animais. Um resultado negativo trata-se de uma elevação da temperatura de 0.5 graus ou superior em apenas 2 dos 8 coelhos ou se a subida de temperatura em todos os 8 não exceder os 3.3 graus Celsius.

O limite das endotoxinas é expresso em K/M em que K é o limiar da dose de pirogénicos tanto para humanos como para coelhos cobaia com o valor de 5 EU/kg e M a dose máxima de administração em humanos por quilograma numa hora. Injeções intratecais têm um valor para K de 0.2 EU/kg.

Existem numerosas limitações na utilização do teste pirogénico em coelho para determinação do conteúdo em endotoxinas, uma vez que as endotoxinas e os pirogéneos se tratam de duas entidades totalmente distintas. Uma endotoxina é uma molécula contida na parede celular de bactérias Gram-negativas e são pirogéneos reconhecidos. Por outro lado, pirogéneos propriamente ditos são toda e qualquer substância capaz de desencadear uma resposta febril tanto em humanos como em coelhos, englobando assim muitas outras entidades e situações para além das endotoxinas. As micobactérias, os fungos e os vírus não possuem endotoxinas e são também capazes de causar reações febris. Nós próprios possuímos pirogéneos endógenos, substâncias inerentes ao nosso sistema metabólico capazes de induzir febre. Por exemplo, temos interleucinas que se sabe aumentarem a temperatura corporal na ativação da resposta inflamatória ou hormonas tiroideias e estrogénios capazes de fazerem subir ou descer a temperatura do corpo consoante o estado de atividade. Simultaneamente, agentes pirogénicos exógenos quando introduzidos no nosso organismo podem causar uma resposta febril. Bactérias, as suas toxinas, vacinas e outros microrganismos como fungos, vírus e organismos parasíticos podem produzir febre. Sangue e seus derivados quando transfundidos podem determinar a elevação da temperatura corporal, assim como medicação que entre outras reações corporais que causa pode também a incluir.

MAIS SOBRE LAL: O impacto das endotoxinas sobre o corpo humano

Outros estados também podem conduzir a elevação da temperatura acima dos valores basais. O exercício físico causa um aumento das taxas metabólicas: o incremento na circulação sanguínea e o rápido metabolismo celular determinam uma febre transitória, assim como o stress emocional ou a euforia. Um tumor ou neoplasia, com o aumento das suas necessidades metabólicas e a libertação de substâncias pirogénicas endógenas pode também desencadear episódios de febre. O controlo da temperatura corporal é feito pelo hipotálamo e, como tal, qualquer defeito ou trauma ao órgão pode alterar a regulação basal. Também o sistema nervoso central pode alterar a temperatura corporal.

Como existem tantos fatores causadores de pirexia, existem também muitas contribuições para disparidade no teste pirogénico em coelho. Trata-se de um teste in vivo, não tem qualquer tipo de especificidade para endotoxinas bacterianas e apresenta variabilidade interespecífica, intraespecífica e individual. Como o teste pirogénico em coelho foi desenvolvido para a deteção de endotoxinas rapidamente se apontaram as limitações enunciadas.

Tratando-se de um teste in vivo, vários estudos mostraram que exposições múltiplas a endotoxinas e pirogéneos produzem tolerância nas cobaias animais. Com o passar do tempo e após numerosos testes, a resposta febril do coelho teve tendência a diminuir. A bactéria Legionella pneumophilia também foi identificada como apenas capaz de causar uma ligeira pirexia nos coelhos, enquanto que pelo método de LAL é rapidamente detetada. De facto, uma discrepância múltipla de 1000 foi descoberta na comparação da capacidade de deteção dos dois testes para a endotoxina Legionella. L. pneumophilia é a bactéria responsável pelo notório surto de pneumonia entre os participantes da Convenção da Legião Americana no Hotel Bellevue-Stratford em Filadélfia em 1976. A tragédia em causa envolveu 182 casos e resultou na morte de 29 pessoas.

O teste em coelho foi considerado inadequado para a deteção de substâncias pirogénicas em produtos de radioterapia, medicamentos de quimioterapia, esteroides, narcóticos e outras substâncias com probabilidade inerente de reagir com o sistema imunitário humano e produzir reações pirogénicas mesmo na ausência de pirogéneos bacterianos. Isto conduziria a inúmeros resultados falso-positivos. O teste pirogénico é também obviamente mais caro, trabalhoso e consume mais tempo ao utilizador, com o maior inconveniente de não ser capaz de quantificar os níveis de endotoxinas.

Recordando a fábula, o coelho foi rápido e teve um início forte. Na comparação entre o teste pirogénico em coelho e LAL, o coelho é agora comparado com o caranguejo-ferradura que, à semelhança da tartaruga, é um lento residente do mar. O teste pirogénico foi adaptado pela Farmacêutica U.S. no início dos anos de 1940, precedendo o uso de testes de endotoxinas pelo método de LAL por 30-40 anos. Graças às vantagens do procedimento de LAL no que refere aos custos, especificidade, menor variabilidade, conveniência e capacidade de quantificação, o teste LAL já substituiu o teste pirogénico na deteção da presença de endotoxinas bacterianas. Assim, na nossa história, o caranguejo-ferradura ultrapassou inegavelmente o coelho.

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Lisa
Por: Lisa Komski Em: Kit LAL