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O presente e o futuro de LAL (Limulus Amebocyte Lysate)

3rd June 2014

O presente e o futuro de LAL (Limulus Amebocyte Lysate)Desde os anos 50 apareceram os primeiros ensaios para endotoxinas bacterianas utilizando o método de  LAL (Limulus Amebocyte Lysate)  

Isso remonta a época em que os pesquisadores liderados por Frederick Bang, no Laboratório de Biologia Marinha, Woods Hole, Massachusetts (EUA), descobriram que o sangue azul do caranguejo-ferradura americano (Limulus polyphemus), um dos seres vivos mais antigos que existem, um fóssil vivo que habita nosso planeta há cerca de 445 milhões de anos, muito antes dos dinossauros, porém, possuia uma característica sem precedentes. A hemolinfa deste coagulava contra as bactérias gram-negativas, causando uma reação peculiar.

No entanto, esse fato só tomou força só quando Levin e Bang descobriram que o fenômeno da coagulação do sangue do Limulus é de natureza enzimática, com topolocalização destas enzimas em grânulos dos amebócitos de Limulus em correspondência com a presença de moléculas chamadas coagulógenos. Os autores mencionados mostraram que a coagulação é iniciada por um componente estrutural original de bactérias Gram-negativas, conhecido como lipopolissacarídeos.

Hoje em dia, se aceita que não é uma reação isolada, mas sim uma reação em cascata de passos de ativação enzimática, que termina com uma clivagem da proteína, gerando uma proteína insolúvel que se liga por interação iônica. Se encontrarmos uma quantidade suficiente desta coagulina, uma turvação aparece, seguida pela formação de um coágulo formado de consistência como um gel visível. Assim, surgiu o fundamento que embasou o método para detectar a presença de endotoxinas bacterianas, denominado teste de lisado de amebócitos de Limulus- Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Também reconhecido por alguns como o teste de endotoxina (BET).

O método de LAL (Limulus Amebocyte Lysate) foi oficialmente aprovado pelo FDA (EUA Food and Drug Administration), nos anos 70, mantendo-se até hoje o princípio orientador e a base de evidências atuais, e ponto de partida dos resultados obtidos por Bang e sua equipe. Na verdade, a United States Pharmacopeia (USP) estabelece a quantificação de pirogênios ou lipopolissacarídeos para mais de 90% dos medicamentos parenterais.

A indústria farmacêutica exige provas que devem ser caracterizadas por serem rápidas, reprodutíveis, simples, mas acima de tudo, confiáveis. A determinação de endotoxinas bacterianas não é uma exceção, por isso a busca constante para encontrar novos métodos a fim de determinar a presença destes e cumprir as normas de Qualidade e Boas Práticas nos produtos farmacêuticos, de biotecnologia e de alimentos manteve-se um campo aberto de pesquisa e desenvolvimento.

Assim, vários métodos têm sido desenvolvidos como o chamado de "Gel Clot", que é um teste qualitativo de detecção de endotoxinas.

Quando for necessário fazer um estudo quantitativo da presença de endotoxinas bacterianas aplica-se o método Cinético Turbidimétrico (KTA, sua sigla em Inglês), sendo o mais sensível dos testes LAL, com sensibilidades tão baixas quanto 0,01 EU/ ml, em que é importante mencionar seu baixo custo, alta velocidade e sensibilidade. Neste ensaio, a resposta de ativação é diretamente proporcional à concentração de endotoxina presente na amostra, medida utilizando-se um espectrofotômetro através de uma reação subsequente com um substrato.

Após o método Cinético Turbidimétrico (KTA) seguiu-se o uso de substâncias cromogênicas que são colocadas num leitor de placa com incubadora e se monitora  o desenvolvimento de uma cor amarela com o passar do tempo. No entanto, alguns autores sugerem que este método seja mais complicado e demorado do que o método de leitura do ponto final.

Também foram desenvolvidos outros métodos, tais como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e eletroforese (SDS-PAGE) que provaram ser pesados, lentos, e não alteram as propriedades excepcionais de LAL. Outros métodos utilizaram ELISA (Enzyme-LinkedImmunoabsorbentAssay). Este método é baseado na determinação da concentração residual de coagulogênios que não tenham reagido com o lipopolissacarídeo presente nas amostras. Nestes encontramos a necessidade de utilização de anticorpos monoclonais que são altamente dispendiosos, mas tem como grande vantagem o baixo volume necessário de amostra.

Isso faz considerar que o método Cinético Turbidimétrico (KTA) para determinar LAL permanece válido, mas novos desafios, no entanto, como sempre acontece na ciência, espreitam o seu desempenho. Atualmente, existe uma corrente crescente em aplicar a nanotecnologia para a ciência médica, particularmente no tratamento de câncer, entre outros motivos, para reduzir a dose dos ativos. Um novo problema surge ao descobrir que algumas nanopartículas estão contaminadas com lipopolissacarídeos, mas a urgência é que as determinações de endotoxinas bacterianas com LAL fornecem falsos positivos com alguns destes sistemas de nanopartículas, que se esclarece quando são aplicadas as técnicas RPT (teste Rabbitpyrogen).

Estes e outros desafios estão presentes neste tema emocionante.

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Lisa
Por: Lisa Komski Em: Kit LAL