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Princípios em que se baseia o teste de Limulus para a detecção de endotoxinas bacterianas

25th February 2016

Princípios em que se baseia o teste de Limulus para a detecção de endotoxinas baO ensaio de LAL ou teste de Limulus é utilizado para a determinação de endotoxinas bacterianas em uma quantidade grande de amostras, tanto nos laboratórios de pesquisa como nas indústrias. O princípio deste teste é o processo de coagulação em que é produzida a hemolinfa do caranguejo ferradura (Limulus Polyphemus) na presença de lipopolissacarídeos. Neste artigo descrevemos o processo biológico e o método utilizado para o desenvolvimento do ensaio.

A coagulação da hemolinfa do caranguejo ferradura acontece mediante uma série de reações em cascata, similares às dos mamíferos. Para que esta cascata de reações seja ativada, as pró-enzimas de serina-proteases presentes na hemolinfa reagem sucessivamente até provocar o processo de gelificação. Uma característica significativa das reações de coagulação que ocorrem no caranguejo Limulus é a ativação com quantidades muito pequenas de lipopolissacarídeos (LPS); concentrações em ordem de picogramas de endotoxinas bacterianas que entrem em contato com a hemolinfa já é o suficiente para que sejam produzidas as reações. Estas reações têm a função de imobilizar os micro-organismos patógenos, que morrem devido a substâncias antimicrobianas secretadas paralelamente e liberadas na hemolinfa.

O fato de que muitos dos precursores necessários para que os coágulos sejam formados na hemolinfa do caranguejo ferradura sejam encontrados na hemolinfa em forma de grânulos, os chamados amebócitos, os pesquisadores desenvolveram um método de análise de endotoxinas bacterianas a partir da extração de hemolinfa de caranguejo. Este ensaio é conhecido com o nome de lisado de amebócitos de Limulus (LAL), uma vez que precisamente é realizado um lisado dos grânulos, para que na presença de endotoxinas aconteça uma reação no meio do ensaio e se produza a formação do gel. A gelificação é o sinal analítico utilizado para a detecção tanto qualitativa, quanto quantitativa dos LPS. Para realizar o ensaio, é extraída uma quantidade de hemolinfa de cada caranguejo e o animal é deixado em seu meio ambiente.

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Se nos aprofundarmos mais no processo biológico que ocorre na hemolinfa do caranguejo ferradura na presença de LPS vemos que se pode separar uma série de processos de ativação de pró-enzimas até enzimas por proteólise: - o LPS ativa autocataliticamente a reação da pró-enzima do fator C em sua transformação ao fator C ativado; - o fator C, por sua vez, ativa o fator B; - o fator B converte a pró-enzima formadora do gel da enzima. A enzima de coagulação resultante é a encarregada de ancorar no coagulogênio duas unidades peptídicas, formando um gel inssolúvel3a. Esta molécula é similar ao fibrogênio nos artrópodes.

A cascata de coagulação, descrita anteriormente, também é ativada pelo (1,3) -β-D-glucano, neste caso, mediante a ativação do fator GF, que é outra pró-enzima da serina-protease, e que também provoca a formação da enzima formadora de gel. Por esta razão, se considera o β-D-glucano como um interferente do ensaio de LAL para a medição de endotoxinas. Os pesquisadores da Wako estudaram que adicionando a curdlana no meio onde se desenvolve o ensaio de endotoxinas pelo método LAL, se elimina a interferência do (1,3)-β-D-glucano. Na empresa Wako, o curdlana carboximetilado é adicionado à mistura de reagentes liofilizados preparados para os ensaios, como no caso do teste ES-F, da Pyrostar e a série Limulus PS, certificando-se de obter resultados confiáveis na determinação de LPS.

Podemos afirmar que o teste de LAL é um método de teste simples e muito sensível para endotoxinas bacterianas, que é empregado na atualidade como o mais eficiente para a determinação deste tipo de substâncias. O método original era realizado de maneira qualitativa ou semi quantitativa: a presença de endotoxinas era determinada pela leitura da formação de coágulo de gel depois da incubação de uma amostra com o lisado de amebócitos a 37°C, durante uma hora. Atualmente, foram desenvolvidos métodos quantitativos de grande eficácia que permitem que se conheça a quantidade exata de endotoxinas bacterianas contidas em uma amostra, como o Limulus Color KY, que se baseia no método colorimétrico.

Bibliografia:

  1. Iwanaga S., Curr. Opin. Immunol. 5, 74–82, 1993.
  2. Levin J., Bang F.B., Bull. Johns Hopkins Hosp. 115, 265–274, 1964.
  3. Iwanaga S., Morita T., Harada T., Niwa M., Takada K., Kimura T., Sakakibara S., Haemostasis 7, 183–188, 1978.
  4. J. Kambayashi, et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 22, 2, 93-100, 1991.

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Por: Lisa Komski Em: Kit LAL