Teste LAL: precauções ao pesquisar sobre produtos farmacêuticos

Há várias décadas se comprovou que o método mais eficiente para a determinação de pirogênios em amostras de produtos farmacêuticos, independentemente da forma de apresentação do princípio ativo é o teste de LAL (Lisado de amebócitos de Limulus). Pelo teste de LAL se determina a presença de endotoxinas bacterianas, moléculas de lipopolissacarídeos (LPS) que formam parte da parede celular das bactérias Gram-negativas e que são o mais frequente, e além disso é o mais perigoso dentre os pirogênios presentes nos produtos da indústria farmacêutica.

O método de LAL surgiu como um ensaio qualitativo de presença de endotoxinas. O gel formado, produto da coagulação da hemolinfa do caranguejo ferradura quando entra em contato com LPS, serviu como sinal analítico aos pesquisadores que desenvolveram o método. Com o passar dos anos a utilidade do teste de LAL se ampliou, com o aparecimento de diferentes maneiras de realizar a medição de modo quantitativo. Atualmente, já se pode adquirir os kits para desenvolver o ensaio usando métodos de detecção como o colorimétrico e o turbidimétrico. A empresa Wako, através de sua linha PYROSTAR™, distribui exemplos desses kits, como o Kit KY Color de Limulus e o PYROSTAR™ ES-F/Plate.

Para fazer o teste de LAL, em que o índice de erros seja mínimo, deve-se considerar algumas precauções. Um ponto de grande importância que deve estar presente é a ubiquidade das bactérias Gram-negativas, que podem ser encontradas em qualquer meio, porque são diversas as fontes de contaminação a que estão expostas as amostras de produtos farmacêuticos. As endotoxinas bacterianas podem se originar tanto de pessoal e do equipamento em contato com as amostras, quanto do ambiente ou das matérias-primas usadas nos processos de fabricação. Nos laboratórios de pesquisa, onde muitas vezes são abertas diferentes linhas de estudo, pode existir contaminação cruzada nas câmaras frias, onde se armazenam as amostras, nas bancadas de trabalho ou no instrumental do laboratório. Para minimizar os riscos deste tipo de contaminação, podem ser comprados para o teste de LAL utensílios e reagentes livres de endotoxinas bacterianas, por exemplo, água destilada livre de endotoxinas.

Também deve-se lembrar que de acordo com o tipo de bactéria de onde provém a endotoxina, a molécula de LPS muda e nem todas são reconhecidas com o mesmo índice de recuperação. Dependendo do antígeno O, que forma parte da estrutura do LPS e do grau de acilação da molécula, muda a hidrofobicidade da mesma, por isso não se comportam da mesma forma em procedimentos de detecção que implicam diluições, por exemplo. Da mesma forma, a distribuição de cargas no LPS varia e isto traz consigo efeitos eletrostáticos diferentes que incidem nos processos de reconhecimento. A natureza da endotoxina também pode variar devido à própria adaptação de uma bactéria em situações de stress, para conseguir uma maior proteção, um mecanismo de defesa da bactéria pode mudar a estrutura dos LPS que estão formando sua membrana. Todas essas características influenciam na agregação supramolecular dos diferentes LPS, que afetam grandemente o reconhecimento, pois se apresentam em forma de agregados, que não produzem a ativação da cadeia de reações que desencadeia na coagulação da hemolinfa do lisado de amebócitos de Limulus.

Todos os aspectos considerados anteriormente incidem no grau de detecção de um ensaio de LAL, quando se realiza a análise de uma amostra farmacêutica ou de outra natureza. Os pesquisadores precisam comprovar que os resultados não são falsos, pois em certas ocasiões, o uso de soluções de endotoxinas como padrão pode levar a erros nas medições. Não se pode assumir que as endotoxinas mascaradas, seja por formar agregados supramoleculares ou o por outros fatores, não vão causar danos em organismos vivos. Todas as precauções que são tomadas em testes usando o método de LAL são necessárias para assegurar a confiabilidade dos resultados.

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