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Pyrostar ES-F Plate com CPE


Pyrostar ES-F Plate com CPE

PYROSTAR™ ES-F/Plate

Ampola multiteste com (2,0 mL e 5,2 mL) com o Controle Padrão de Endotoxina (CPE) Uso: Lisado de Amebócitos de Límulo (LAL) destina-se à detecção de endotoxinas bacterianas gram-negativas. O PYROSTAR™ ES-F/Plate é para a detecção quantitativa de endotoxinas por métodos turbidimétricos cinéticos, usando um leitor de microplacas. A escala quantitativa para o Ensaio Cinético Turbidimétrico (ECT) é de 0,01 a 10EU/mL.

 A Série PYROSTARTM ES-F


Reference:
WPEPK4-20015

Escala Quantitativa de ECT (EU/mL)

0,01 a 10

Resumo e Informações Gerais

A endotoxina (lipopolissacarídeo ou LPS) é um componente da membrana exterior das bactérias gram-negativas. Uma vez que as endotoxinas, quando injetadas ou implantadas, podem causar febre e/ou o choque, a detecção de endotoxinas bacterianas nos produtos farmacêuticos e nos dispositivos médicos é crucial.

O teste de LAL é o método mais sensível para a detecção dos endotoxinas bacterianas atualmente aprovado pelo FDA.2 A primeira metodologia usada para determinar os resultados de teste de LAL era a formação de um gel-clote no fundo de um tubo de reação de vidro. Também foi observado que a solução do teste se tornava turva antes da formação do gel. O tempo necessário  para produzir um nível específico de turvação é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina em uma amostra.1

Um instrumento fotométrico, tal como o Leitor de Microplacas (leitor de microplacas Tecan Sunrise ou equivalente) é usado para medir a taxa da mudança da turvação. Este procedimento quantitativo é frequentemente chamado de Ensaio Cinético Turbidimétrico (ECT).

Utilizando estas propriedades, a Wako Produtos Químicos desenvolveu um teste de endotoxina de LAL que pode ser usado como teste turbidimétrico quantitativo.

O teste de endotoxinas bacterianas da USP <85>6 fornece procedimentos padronizados para a validação antes do uso rotineiro.

No entanto, a especificidade de LAL não é absoluta.7 Relatou-se que LAL reage não somente com a endotoxina, mas também com o β-1, 3-glucano. Embora o sistema em cascata ativado por β-1,3-glucano mostrou ser diferente do que o sistema ativado pela endotoxina,8 o resultado final, formação de gel (gel-clote), é indistinguível.

A ativação de LAL pelo glucano em uma amostra pode ser evitada ao adicionar uma quantidade grande de carboximetil-curdlan (gel de polissacarídeo) (CMC) ao LAL. A presença de grandes quantidades de glucano não interfere na quantitação de endotoxina. A Wako empregou primeiramente estes resultados desenvolvendo um tampão-ES, que contém altas concentrações de CMC. Quando o tampão-ES é usado para reconstituir LAL, o reagente de LAL torna-se específico para endotoxina. PYROSTAR™ ES-F/Plate é uma preparação nova de LAL em que o CM-curdlan é co-liofilizado com LAL. Reconstituindo o teste de ampola de PYROSTAR™ ES-F/Plate com água reagente de LAL resulta em um reagente de LAL específico para endotoxina. 

História e princípio biológico

A detecção in vitro da endotoxina bacteriana foi feita primeiramente por Levin e Bang.3 A descoberta feita por eles mostrou que o sangue do caranguejo ferradura, Limulus polyphemus, coagula na presença de bactérias gram-negativas. Em seguida, esses pioneiros relataram que todos os componentes necessários para a formação do clote poderiam ser isolados dos amebócitos adjacentes encontrados no sangue do Limulus .3.4

Foi lançado um guia pelo FDA (a agência de administração de alimentos e medicamentos dos Estados Unidos) em 19875 para informar aos fabricantes de medicamentos para humanos, medicamentos veterinários e dispositivos médicos sobre os procedimentos que o FDA considera necessários para validar o uso de LAL como produto final do teste de endotoxina. O guia do FDA foi combinado com o Teste de Endotoxinas Bacterianas da USP em 2000, fazendo com que o método da USP fosse considerado padrão para os fabricantes nos Estados Unidos. O Guia do FDA de 1987 foi retirado em 2011. 

Avisos e precauções gerais

PYROSTAR™ ES-F/Plate é destina-se à detecção in vitro de endotoxinas bacterianas gram-negativas. Tome cuidado ao manusear LAL porque sua toxidez é desconhecida.

Este teste não é um dispositivo diagnóstico e não deve ser usado determinar níveis de endotoxina nos seres humanos para finalidades diagnósticas.

Reagentes fornecidos

Reagente PYROSTAR™ ES-F/Plate: O PYROSTAR™ ES-F/Plate é um reagente liofilizado que contém lisado de amebócitos de límulo, tampões, carboximetil-curdlan, cátions monovalentes e divalentes.

Preparação: Bata levemente na ampola em uma superfície plana para assegurar-se de que todo o pó esteja depositado no fundo da mesma. Remova delicadamente o tampão e adicione 2 mL ou 5,2 mL de água para reagente de LAL (AR) à ampola. Substitua o tampão e gire delicadamente para dissolver o conteúdo, sem fazer contato com o tampão.

Armazenamento: Acondicione à temperatura de 2 a 10oC. Refrigere o reagente reconstituído entre 2-8°C, por 6 horas no máximo ou em -15±5oC por 14 dias no máximo. O reagente reconstituído só pode ser congelado e descongelado uma vez.

Controle Padrão de Endotoxina (CPE) Um reagente liofilizado que contém endotoxina refinada de E.coli e que é usado para confirmar a sensibilidade do reagente de LAL, validar métodos de teste de produtos e preparar controles de inibição.

Preparação: Libere o vácuo delicadamente puxando para cima e removendo o tampão de borracha da ampola. A ampola contém 500 ng de endotoxina. Cada Controle Padrão de Endotoxina é testado, comparando-se com o Padrão de Referência de Endotoxina do FDA, e o fator de conversão (EU/ng) é determinado. O valor do EU (EU/ampola) é impresso na etiqueta. Determine o volume de água para reagente (AR) a ser adicionado à ampola para produzir uma solução de 1.000EU/mL. Adicione o volume determinado de água para reagente (AR) à ampola. Substitua o tampão de borracha, inverta a ampola diversas vezes e misture no agitador de vórtice, vigorosamente, por 2 minutos.

Armazenamento: O CPE reconstituído pode ser armazenado em temperatura de 2-10°C durante 1 mês. CPE não deve ser armazenado em temperaturas abaixo de zero. Quando a solução armazenada for usada, misture vigorosamente a solução no agitador de vórtice durante 1 minuto antes de usar.

 Materiais e equipamentos não fornecidos

Padrão de Referência de Endotoxinas (PRE): Padrão de Referência de Endotoxinas da USP que tem uma potência definida de 10.000 Unidades de Endotoxina da USP (EU).
Água para Reagente LAL (AR): Água livre de endotoxina.
Pipetas livres de endotoxinas
Tubos de diluição livres de endotoxinas
Método de Microplacas
Leitor de Microplacas (Tecan Sunrise ou equivalente)
Microplacas livres de endotoxinas (placa inferior desobstruída Corning® 96 (catálogo de Corning® # 3370) ou equivalente)

PREPARAÇÃO DE DILUIÇÕES para CONTROLE PADRÃO DE ENDOTOXINA

Preparação para Controle Padrão de Endotoxina

Baseado nas informações fornecidas na Certificação de Análise, prepare um padrão de CPE a uma concentração de 1000 EU/mL, como descrito acima. Misture a solução de 1000EU/mL CPE no agitador de vórtice por 2 minutos na temperatura ambiente. Usando a solução de 1000EU/mL CPE, prepare diluições em série de endotoxina, como mostra a Tabela 1.

Misture cada tubo no agitador de vórtice por 30 segundos entre as diluições. As diluições podem ser preparadas em volumes diferentes, contanto que a mesma relação seja mantida.

         Tabela 1             

Esquema da Diluição da Endotoxina

       (diluição em séries de 10)

Concentração inicial de endotoxina. (EU/mL)

Volume adicionado à água para reagente (AR) (mL)

Concentração final de endotoxina. (EU/mL)

1000

0,4+3,6

100

100

0,4+3,6

10

10

0,4+3,6

1

1

0,4+3,6

0.1

0.1

0,4+3,6

0,01

 

COLETA E PREPARAÇÃO DO ESPÉCIME

As reações de LAL são sensíveis ao pH, o que exige que o LAL e a mistura da amostra tenham um pH de 6,0 a 8,0. O PYROSTAR™ ES-F/Plate contém os componentes tampão que ajudam a manter a mistura do teste dentro da escala do pH, na maioria dos casos. Se um ajuste do pH for necessário, o pH da amostra deve ser ajustado com HCI ou NaOH livres de endotoxinas.

 

Interferência do produto

Antes de usar o teste de LAL para a liberação rotineira do produto, é necessário validar a ausência da interferência do produto executando um teste de inibição/realce para cada tipo de produto. Um produto é considerado como não interferente através do teste de uma amostra do produto contaminado com uma quantidade determinada de endotoxina e tal teste detectar 50 - 200% da endotoxina contaminada.

Ensaio Cinético Turbidimétrico (ECT) Prepare uma curva padrão que cubra o alcance do teste. Contamine o produto a um nível de endotoxina que seja igual ou próximo do meio da curva padrão. O produto será considerado não interferente se o nível de endotoxina relatado for 50 a 200% da concentração de endotoxina contaminada. Por exemplo, se uma curva padrão estiver entre 0,1 e 10 EU/mL, o produto deve ser contaminado com endotoxina para resultar uma concentração de 1 EU/mL. O nível aceitável de endotoxina está entre 0,5 e 2,0 EU/mL.

PROCEDIMENTO PARA ENSAIO CINÉTICO TURBIDIMÉTRICO

Um ensaio cinético turbidimétrico (ECT) pode ser executado no Leitor de Microplacas e no software que o acompanha (Tecan Sunrise ou equivalente).

Além do produto que está sendo testado, um ensaio válido incluirá os padrões de endotoxina que suportam a escala da análise, os controles positivos do produto e os controles negativos. Todos os valores do teste necessitam ser determinados pelas amostras duplicadas, pelo menos.

Método de Microplacas:

Todas as amostras, padrões e/ou reagentes devem estar na temperatura ambiente antes do começo deste procedimento:

Transfira assepticamente 0,05 mL (50µL) de cada amostra ou controle de produto à microplaca respectiva, começando com o controle negativo e terminando com a maior concentração de endotoxina. Adicione 0,05 mL (50µL) de reagente PYROSTAR™ ES-F/Plate em cada microplaca que contenha o padrão ou a amostra. Coloque a microplaca no Leitor de Microplacas com as seguintes especificações:

Comprimento de onda:        405nm
No local O.D.:                         0,015
Intervalo da medição:        40sec                       
Temperatura:                  37°C

No fim do período de incubação, o software de Microplaca executará a análise da regressão dos dados da curva padrão e calculará os níveis de endotoxina para cada amostra.

Veja o “Teste de Endotoxinas Bacterianas” na Farmacopeia dos Estados Unidos e consulte as seções que descrevem a curva padrão e a preparação de soluções.6

CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DA ENDOTOXINA

Durante uma reação de ECT, a turvação das soluções do teste é monitorada continuamente pelo Leitor de Microplaca. É medido o tempo necessário para uma amostra alcançar um nível determinado de absorbância de fundo. Esse tempo é mencionado no software do Leitor de Microplacas como Ta (tempo da ativação).

O software produz uma correlação linear do log (eixo-x)/log (eixo-y) do Ta (tempo de ativação) de cada padrão com sua concentração correspondente de endotoxina. Ta é o tempo necessário para o delta OD do padrão/amostra alcançar 0,015. As concentrações de endotoxina em amostras desconhecidas são calculadas através de seu Ta correspondente, usando a curva padrão calculada. Um exemplo de uma série padrão e nível de contaminação de endotoxina de 1,0 EU/mL no produto é apresentado abaixo:

Análise representativa

 

CPE

 

Log

Log

 

 

 (EU/mL)

Ta (segundo)

Concentração

Ta

 

Padrões

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NC

0

NR

------

-------

 

STD1

10

480

1,0000

0,9031

 

STD2

1

792

0,0000

1,1206

 

STD3

0,1

1416

-1,0000

1,3729

 

 

 

 

 

 

 

inclinação

-0,2349

 

 

intercepta o eixo y

1,1322

 

 

coeficiente da correlação

-0,999

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Calculado

Produto 1

 

 

 

 

(EU/mL)

NPC1

 

------

 

------

 

PPC1

 

816

 

1,1335

0,987

 

 

 

 

 

% da recuperação = 98,7%

Produto 2

 

 

 

 

 

NPC2

 

------

 

------

 

PPC2

 

780

 

1,1139

1,196

 

 

 

 

 

% da recuperação = 119,6%

            NR= Não reativo

Nesse exemplo, o controle positivo do produto (PPC) para cada amostra do produto resultou no nível de endotoxina consistente com o nível contaminado, indicando que não há nenhum realce ou inibição detectável no produto. O controle negativo do produto (NPC) e o controle negativo (NC) mostraram níveis significativamente mais baixos de endotoxina do que a concentração padrão mais baixa de endotoxina.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO:

A linearidade da curva padrão dentro da escala de concentração usada para determinar os níveis de endotoxina deve ser verificada. Nada menos do que 3 padrões de endotoxina, na escala de concentração desejada, e branco de reagente da AR devem ser testados triplamente, pelo menos. Consulte a Verificação dos Critérios para a Curva Padrão da USP. O valor absoluto do coeficiente da correlação, lrl, deve ser superior ou igual ao valor de 0,980.6

BIBLIOGRAFIA

1. Cooper, J.F., Levin, J., and Wagner, H.N. “Quantitative Comparison of in Vitro and In Vivo Methods for Detection of Endotoxin” J. Lab, Clin, Med., 78, p.128 (1971).
2. Hochstein, H.D. “The LAL Test versus the Rabbit Pyrogen Test for Endotoxin Detection; Update ’87.” Pharm. Technol., 11(6), p. 124 (1987).
3. Levin, J. and Bang, F.B. “Clottable protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endotoxin.” Thromb. Dieth. Haemonti., 19, p. 186 (1966).
4. Tai, J.Y. and Llu. T.Y. “Studies on Limulus Lysate, Isolation of Pro-clotting Enzyme.” J. Biol, Chem., 252, p.2176 (1977).
5. Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December 1987.
6. “Bacterial Endotoxins Test.” The United States Pharmacopeia, most current version.  U.S. Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.
7. Cooper, J.F., Weary, M.E., and Jordon, J,T. “The Impact of Nonendotoxin LAL-Reactive Materials on Limulus Amebocyte Lysate Analysis.” L. Parent, Sci $ Tech, 51(1), (1966).
8. Tsuchiya, M., Oishi, H., Takaoka, A., Fusamoto, M. and Matsuura, S. “Discrimination between endotoxin and (1 – 3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate.” Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). p. 2523 (1990).

Fabricado por
Wako Chemicals USA, Inc.
LAL Division
1600 Bellwood Road
Richmond, VA 23237
Licença No.:1762