Brochure: La Serie PYROSTAR™ ES-F
Vial multi pruebas (2.0 ml y 5.2 ml) con endotoxina estándar de control (CSE)
Uso previsto: El Limulus amebocyte lysate (LAL) está diseñado para detectar endotoxinas bacterianas Gram-negativas. El PYROSTAR™ ES-F/ Plate está diseñado para detectar las endotoxinas cuantitativamente por medio de métodos cinético turbidimétricos. El rango cuantitativo para el ensayo cinético turbidimétrico (KTA) es:
| Rango cuantitativo KTA (UE/ml) |
| 0.01 a 10 |
La endotoxina (lipopolisacárido o LPS) es un componente de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Puesto que las endotoxinas, cuando se inyectan o se implantan, pueden causar fiebre y/o shock, la detección de endotoxinas bacterianas en dispositivos farmacéuticos y médicos es crítica.
El ensayo LAL es el método más sensible para detectar endotoxinas bacterianas entre los actualmente aprobados por la FDA. La primera metodología utilizada para determinar los resultados de la prueba LAL fue la formación de un coágulo de gel (gel-clot) en la parte inferior del tubo de reacción de vidrio. También se ha observado que la solución de prueba se vuelve turbia antes de la formación de gel. El tiempo requerido para producir un nivel específico de turbidez es inversamente proporcional a la cantidad de endotoxinas en la muestra.
Se utiliza un instrumento fotométrico (como el lector de microplacas Tecan Sunrise™ Microplate Reader o equivalente) para medir la velocidad de cambio de la turbidez. En general, este procedimiento de medición cuantitativa se conoce como ensayo cinético turbidimétrico (KTA).
Mediante la utilización de estas propiedades, Wako Chemicals USA ha desarrollado una prueba de endotoxina LAL que puede emplearse como prueba turbidimétrica cuantitativa.
La prueba de endotoxinas bacterianas USP <85>6 proporciona procedimientos estandarizados para la validación antes de su uso rutinario.
Sin embargo, la especificidad de LAL no es absoluta. Se ha reportado que LAL no sólo reacciona con endotoxina sino también con β-1,3-glucano. Aunque el sistema de cascada activado por β-1,3-glucano ha demostrado ser diferente al que activa la endotoxina, el resultado final, la formación de coágulos de gel, es indistinguible.
La activación de LAL por glucano en una muestra puede prevenirse mediante la adición de una gran cantidad de curdlan carboximetilado (CMC) a LAL. La presencia de grandes cantidades de glucano no interfiere con la cuantificación de endotoxinas. Wako fue el primero que hizo uso de estos hallazgos mediante el desarrollo de un ES-buffer que contiene altas concentraciones de CMC. Cuando se utiliza el ES-buffer para reconstituir LAL, el reactivo LAL se convierte en específico para la endotoxina. El PYROSTAR ES-F / Plate™ es una nueva preparación de LAL en la que el CM-curdlan se co-liofiliza con el LAL. Reconstituir los viales de prueba PYROSTAR™ ES-F / Plate con agua reactiva a LAL da como resultado un reactivo LAL específico para la endotoxina.
La detección in vitro de la endotoxina bacteriana fue iniciada por Levin y Bang3. Sus hallazgos mostraron que la sangre de cangrejo herradura, Limulus polyphemus, coagula en presencia de bacterias Gram-negativas. Posteriormente reportaron que todos los componentes necesarios para la formación del coágulo podían ser aislados de los amebocitos circundantes encontrados en la sangre de Limulus3,4.
La U.S. Food and Drug Administration (FDA) emitió una directriz en 19875 para informar a los fabricantes de medicamentos de uso humano y productos biológicos, medicamentos veterinarios y dispositivos médicos, sobre los procedimientos que la FDA consideraba necesarios para validar el uso del LAL como un producto final para pruebas de endotoxinas. La pauta de la FDA se combinó con la prueba de endotoxinas bacterianas USP en el año 2000, haciendo del método USP el método estándar para los fabricantes en EE.UU. La directriz de la FDA de 1987 se retiró en 2011.
El PYROSTAR™ ES-F/Plate está diseñado para la detección in vitro de endotoxinas bacterianas Gram-negativas. Tenga cuidado al manipular LAL ya que su toxicidad aún se desconoce.
Esta prueba no es un dispositivo de diagnóstico y no debe usarse para determinar los niveles de endotoxina en seres humanos para propósitos de diagnóstico.
Reactivo PYROSTAR™ ES-F/Plate: El PYROSTAR™ ES-F/Plate es un reactivo liofilizado que contiene Limulus amebocyte lysate, buffers, carboximetil curdlan, cationes monovalentes y divalentes.
Endotoxina estándar de control (CSE): Es un reactivo liofilizado que contiene endotoxina refinada a partir de E.coli y se utiliza para confirmar la sensibilidad del reactivo LAL, validar los métodos de prueba del producto y preparar controles de inhibición.
Endotoxina estándar de referencia (RSE): Una endotoxina estándar de referencia USP que tiene una potencia definida de 10,000 unidades de endotoxina (UE) USP.
Agua reactiva a LAL (LRW): Agua sin endotoxina.
Pipetas sin endotoxina
Tubos de dilución sin endotoxina
Método de microplacas
Con base en la información proporcionada en la Certificación de Análisis, prepare una CSE estándar con una concentración de 1000 UE/ml, como se describió anteriormente. Agite la solución CSE 1000 UE/ml durante 2 minutos a temperatura ambiente. Utilizando la solución de CSE 1000 UE/ml, prepare la serie de diluciones de endotoxina como se muestra en la Tabla 1.
Agite girando cada tubo durante 30 segundos entre las diluciones. Las diluciones se pueden preparar en diferentes volúmenes, siempre y cuando se mantenga la misma proporción.
Tabla 1
Esquema de dilución para muestra de endotoxina
(Serie de dilución de 10 veces)
|
Conc. inicial de endotoxina (UE/ml) |
Volumen añadido a LRW (ml) |
Conc. final de endotoxina (UE/ml) |
|
1000 |
0.4 + 3.6 |
100 |
|
100 |
0.4 + 3.6 |
10 |
|
10 |
0.4 + 3.6 |
1 |
|
1 |
0.4 + 3.6 |
0.1 |
|
0.1 |
0.4 + 3.6 |
0.01 |
Las reacciones LAL son sensibles al pH y requieren que la mixtura de la muestra LAL tenga un pH de 6.0 a 8.0. El PYROSTAR™ ES-F/Plate contiene componentes neutralizadores que ayudan a situar la mezcla de prueba dentro del intervalo de pH en la mayoría de los casos. Si es necesario adecuar el pH, éste debe ajustarse con HCl o NaOH sin endotoxinas.
Antes de usar la prueba LAL para la entrega de rutina del producto, es necesario validar la ausencia de interferencia del producto mediante la realización de una prueba de inhibición/mejora para cada tipo de producto. Un producto se determina que no interfiere probando una muestra fortalecida del producto con una cantidad conocida de endotoxina y la detección de 50 - 200% de la endotoxina fortalecida.
Ensayo cinético turbidimétrico (KTA): Prepare una curva estándar que cubra el rango de prueba. Fortalezca el producto a un nivel de endotoxina que sea igual o aproximado a la mitad de la curva estándar. Se determina que el producto no interfiere si el nivel de endotoxina reportado es de 50 a 200% de la concentración de endotoxina fortalecida. Por ejemplo, si una curva estándar se realiza entre 0.1 y 10 UE/ml, el producto debe ser fortalecido con endotoxina para producir una concentración de 0.1 UE/ml. La recuperación de endotoxinas aceptable se encuentra entre 0.5 y 2.0 UE/ml.
El ensayo cinético turbidimétrico (KTA) puede realizarse con el lector de microplacas y su software asociado (Tecan Sunrise™ Microplate Reader o equivalente).
Además de la prueba del producto, un ensayo válido incluirá estándares de endotoxinas que abarquen el rango de análisis, controles positivos del producto y controles negativos. Todos los valores de las pruebas deben determinarse a partir de, al menos, muestras duplicadas.
Todas las muestras, estándares y/o reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de comenzar el siguiente procedimiento.
Transfiera en condiciones de asepsia 0.05 ml (50μL) de cada muestra del producto o de control a la microplaca respectiva, comenzando con el control negativo y terminando con la concentración más alta de endotoxina. Añada 0.05 ml (50μL) del reactivo PYROSTAR™ ES-F/Plate en cada microplaca que contenga estándar o muestra. Ponga la microplaca en el lector de microplacas con las siguientes especificaciones:
Longitud de onda: 405 nm
O.D. in situ: 0.015
Intervalo de medida: 40 seg
Temperatura: 37 °C
Al final del periodo de incubación, el software de microplacas efectuará un análisis de regresión de los datos de la curva estándar y calculará los niveles de endotoxina para cada muestra.
Consulte las “Pruebas de endotoxinas bacterianas” en la Farmacopea de EE.UU. y busque las secciones que describen la curva estándar y la preparación de soluciones6.
Durante una reacción KTA el lector de microplacas monitorea continuamente la turbidez de las soluciones de prueba. Se mide el tiempo requerido para que la muestra alcance un nivel de absorción determinado sobre el antecedente. Este tiempo se reconoce por el software del lector de microplacas como Ta (tiempo de activación).
El software produce un registro log(eje x)/log(eje y) de correlación lineal del Ta (tiempo de activación) de cada estándar con su correspondiente concentración de endotoxina. El Ta es el tiempo requerido para que el delta OD del estándar/muestra llegue a 0.015. Las concentraciones de endotoxina en muestras desconocidas se calculan a partir de su correspondiente Ta utilizando la curva estándar calculada. A continuación se presenta un ejemplo de una serie estándar y la recuperación de una endotoxina fortalecida de 1.0 UE/ml en el producto.
|
CSE |
Log |
Log |
|||
|
(UE/ml) |
Ta (seg) |
Concentración |
Ta |
||
|
Estándares |
|||||
|
NC |
0 |
NR |
------ |
------- |
|
|
STD1 |
10 |
480 |
1.0000 |
0.9031 |
|
|
STD2 |
1 |
792 |
0.0000 |
1.1206 |
|
|
STD3 |
0.1 |
1416 |
-1.0000 |
1.3729 |
|
|
pendiente |
-0.2349 |
||||
|
y-intercep |
1.1322 |
||||
|
coeficiente de correlación |
-0.999 |
||||
|
UE/ml |
|||||
|
Producto 1 |
calculado |
||||
|
NPC1 |
------ |
------ |
|||
|
PPC1 |
816 |
1.1335 |
0.987 |
||
|
% recuperado = 98.7% |
|||||
|
Producto 2 |
|||||
|
NPC2 |
------ |
------ |
|||
|
PPC2 |
780 |
1.1139 |
1.196 |
||
|
% recuperado = 119.6% |
|||||
NR = No reactivo
En este ejemplo, el control positivo del producto (PPC) para cada muestra del producto producido por recuperación de endotoxinas en consonancia con el nivel fortalecido indica que no hay mejora ni inhibición detectables en el producto. El control negativo del producto (NPC) y el control negativo (NC) mostraron niveles significativamente inferiores de endotoxina que la menor concentración de endotoxina estándar.
La linealidad de la curva estándar en el intervalo de concentración utilizado para determinar los niveles de endotoxinas debe verificarse. No menos de 3 estándares de endotoxina, que abarcan el rango de concentración deseado, y el agua estéril LRW deben ser analizados al menos por triplicado. Consulte la verificación de criterios para la curva estándar en USP. El valor absoluto del coeficiente de correlación, lrl, será mayor que o igual al valor 0.9806.
1. Cooper, J.F., Levin, J., and Wagner, H.N. “Quantitative Comparison of in Vitro and In Vivo Methods for Detection of Endotoxin” J. Lab, Clin, Med., 78, p. 128 (1971).
2. Hochstein, H.D. “The LAL Test versus the Rabbit Pyrogen Test for Endotoxin Detection; Update ’87.” Pharm. Technol., 11(6), p. 124 (1987).
3. Levin, J. and Bang, F.B. “Clottable protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endotoxin.” Thromb. Dieth. Haemonti., 19, p. 186 (1966).
4. Tai, J.Y. and Llu. T.Y. “Studies on Limulus Lysate, Isolation of Pro-clotting Enzyme.” J. Biol, Chem., 252, p. 2176 (1977).
5. Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December 1987.
6. “Bacterial Endotoxins Test.” The United States Pharmacopeia, most current version. U.S. Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.
7. Cooper, J.F., Weary, M.E., and Jordon, J.T. “The Impact of Nonendotoxin LAL-Reactive Materials on Limulus Amebocyte Lysate Analysis.” L. Parent, Sci Tech, 51(1), (1966).
8. Tsuchiya, M., Oishi, H., Takaoka, A., Fusamoto, M. and Matsuura, S. “Discrimination between endotoxin and (1–3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate.” Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). p. 2523 (1990).
Wako Chemicals USA, Inc.
LAL Division
1600 Bellwood Road
Richmond, VA 23237
Licencia No. 1762
