Causas del fenómeno de recuperación baja de endotoxinas (LER) y en qué se diferencia de la interferencia típica
Las endotoxinas son pirógenos que se encuentran en la membrana externa de las bacterias gramnegativas y pueden causar fiebre y sepsis si entran en el torrente sanguíneo humano. Para garantizar la seguridad de los pacientes, los medicamentos administrados por vía parenteral y los dispositivos médicos se someten a rigurosas pruebas para detectar la contaminación por endotoxinas. Sin embargo, fenómenos como la recuperación baja de endotoxinas y la interferencia típica con el ensayo LAL pueden dar lugar a resultados inexactos en las pruebas [1].
¿Qué es la recuperación baja de endotoxinas?
El término recuperación baja de endotoxinas describe el fenómeno de la reducción significativa de la recuperación de endotoxinas adicionadas a determinadas matrices con el paso del tiempo. Dicha reducción de las endotoxinas detectables con el paso del tiempo puede dar lugar a una cuantificación imprecisa de las endotoxinas con el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL).
¿Con qué riesgos se asocia la recuperación baja de endotoxinas?
El fenómeno de la recuperación baja de endotoxinas es motivo de preocupación para los fabricantes de medicamentos administrados por vía parenteral, ya que la capacidad de detectar y cuantificar los contaminantes de endotoxinas naturales en determinadas matrices también puede disminuir con el tiempo. Como resultado, puede aumentar el riesgo de obtener resultados falsos negativos en las pruebas de endotoxinas.
¿En qué se diferencia la recuperación baja de endotoxinas de la interferencia típica del ensayo LAL?
Tanto la recuperación baja de endotoxinas como la interferencia típica del ensayo LAL pueden dar lugar a resultados de pruebas imprecisos y poco confiables. Sin embargo, sus mecanismos y las estrategias para su detección y eliminación son diferentes.
Diferencias en los mecanismos que subyacen a la recuperación baja de endotoxinas y la interferencia típica en el ensayo LAL
La recuperación baja de endotoxinas puede producirse cuando las endotoxinas están enmascaradas o secuestradas en la matriz de un fármaco. Los excipientes de los fármacos pueden influir en este proceso al alterar el estado de agregación de las endotoxinas, haciéndolas menos accesibles o reactivas al reactivo LAL. Como resultado, es posible que se detecte una cantidad reducida de endotoxinas, aunque sigan estando presentes en la matriz. Por lo general, el fenómeno de la recuperación baja de endotoxinas depende del tiempo y también puede depender de la temperatura.
Por el contrario, en la interferencia típica del ensayo LAL, una sustancia presente en la muestra analizada interfiere con el reactivo LAL o la cascada, inhibiendo o potenciando la reacción LAL. La inhibición de la reacción LAL puede dar lugar a una subestimación de la endotoxina y a resultados falsos negativos. Entre los factores que pueden inhibir la reacción LAL se incluyen un pH fuera del rango óptimo de 6-8; la presencia de metales pesados, agentes quelantes o inhibidores enzimáticos; y concentraciones elevadas de sal. Una intensificación de la reacción LAL puede dar lugar a una sobreestimación del contenido de endotoxinas y a resultados falsos positivos. Entre los factores que pueden aumentar la reacción LAL se incluyen los (1→3)-β-D-glucanos y ciertos tensioactivos y proteínas. La interferencia típica en el ensayo LAL es generalmente independiente del tiempo.
¿Cómo se pueden detectar la recuperación baja de endotoxinas y la interferencia típica del ensayo LAL?
Los métodos para identificar la recuperación baja de endotoxinas y la interferencia típica del ensayo LAL también difieren. La recuperación baja de endotoxinas se detecta mediante estudios de tiempo de retención, en los que se adiciona una cantidad conocida de endotoxinas a un fármaco y se determina su recuperación tras períodos de tiempo predefinidos. Se observa una recuperación baja de endotoxinas cuando la recuperación disminuye significativamente con el tiempo.
La interferencia típica del ensayo LAL se puede detectar mediante controles positivos y negativos y estudios de adición, en los que se añade una cantidad predeterminada de endotoxinas a una muestra y se examina su recuperación inmediata. La interferencia del ensayo LAL se observa cuando la recuperación inmediata de endotoxinas está fuera de un rango aceptable.
¿Cómo se puede superar la recuperación baja de endotoxinas y la interferencia típica en el ensayo LAL?
Para superar la recuperación baja de endotoxinas, se pueden considerar agentes y protocolos de desenmascaramiento (con el objetivo de interrumpir las interacciones entre la endotoxina y la matriz del producto), fuentes alternativas de endotoxinas y pruebas alternativas de pirógenos [2]. Si una muestra con endotoxinas añadidas presenta una baja recuperación de endotoxinas, también se puede lograr el desenmascaramiento diluyendo la muestra en Agua de Reactivo LAL y analizándola después de 24 horas (en lugar de necesitar un búfer de desenmascaramiento). Además, un pH más bajo mitiga la baja recuperación de endotoxinas, por lo que se puede reducir el pH durante el estudio del tiempo de retención y, a continuación, se puede utilizar un reactivo de prueba de endotoxinas con autobúfer.
Las interferencias típicas en los ensayos LAL pueden resolverse mediante dilución, ajustando el pH de la reacción LAL a su rango óptimo, aplicando calor y utilizando determinados agentes bloqueantes [3].
En general, tanto la recuperación baja de endotoxinas como la interferencia típica del ensayo LAL pueden dar lugar a resultados falsos negativos en las pruebas de endotoxinas, pero sus mecanismos y los enfoques para su detección y eliminación difieren. Debido a los riesgos asociados con los resultados falsos negativos de las pruebas de endotoxinas, es fundamental ser consciente de la recuperación baja de endotoxinas y la interferencia del ensayo LAL.
Referencias
- von Wintzingerode F. (2016). Low endotoxin recovery, a brief overview. American Pharmaceutical Review. https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/239898-Low-Endotoxin-Recovery-A-Brief-Overview/
- Reich J, Weyer FA, Tamura H, Nagaoka I & Motschmann H. (2019). Low endotoxin recovery-masking of naturally occurring endotoxin. International Journal of Molecular Sciences, 20(4): 838. doi:10.3390/ijms20040838
- Sandle T. (2021). Bacterial Endotoxin Test using LAL methodology: overcoming interfering factors. European Pharmaceutical Review. https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/161082/bacterial-endotoxin-test-using-lal-methodology-overcoming-interfering-factors/