¿Cuál es el presente y futuro de LAL (Lisado de amebocitos de limulus)?

Desde la década del 50 encontramos que aparecieron los primeros ensayos para determinar endotoxinas bacterianas utilizando el método del LAL (lisado de amebocitos de Limulus).

Datos curiosos sobre LAL

Esto data de cuando investigadores encabezados por Frederick Bang, en el Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts (EE.UU.), descubrieron que la sangre de color azul del cangrejo herradura americano (Limulus polyphemus), uno de los seres vivos más antiguos que existen, un fósil viviente que habita nuestro planeta desde hace alrededor de 445 millones de años, mucho antes que los dinosaurios, pero lo inédito era que la hemolinfa de este coagulaba frente a bacterias Gram-negativas provocando una peculiar reacción.

Sin embargo solo la idea cobró fuerza cuando Levin y Bang encontraron que el fenómeno de coagulación de la sangre de Limulus es de naturaleza enzimática, con topolocalización de estas enzimas en gránulos de los amebocitos de Limulus en correspondencia con la presencia de moléculas denominadas coagulógenos. Los referidos autores demostraron que la coagulación la inicia un componente estructural exclusivo de bacterias Gram-negativas, reconocidas como lipopolisacáridos.

El Presente y Futuro

Hoy en día se acepta que no es una reacción aislada sino una cascada de pasos de activación enzimática que terminan con la escisión de la proteína generando un producto insoluble que se une por interacción iónica. Si encontramos cantidades suficientes de esta coagulina, aparece turbidez, seguida de la formación de un coágulo de consistencia forme como un gel visible. De esta forma surgió el fundamento que dio base al método para detectar la presencia de estas endotoxinas bacterianas, denominado prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL). También se reconoce por algunos, los menos, como la prueba de detección de endotoxina (BET).

El método LAL (Limulus amebocytelysate) fue aceptado oficialmente por la FDA (U.S. Food and Drug Administration) en los años 70, manteniéndose hasta nuestros días el principio rector y fundamento de las pruebas vigentes, a punto de partida de los resultados obtenidos por Bang y colaboradores. De hecho La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) establece la cuantificación de pirógenos o lipopolisacáridos para más del 90% de los fármacos de uso parenteral.

La industria farmacéutica exige pruebas que se deben caracterizar por ser rápidas, reproducibles, sencillas pero sobre todo, confiables. La determinación de endotoxinas bacterianas no es una excepción, de ahí que la búsqueda incesante para encontrar nuevas vías con vistas a determinar la presencia de estas y cumplimentar las normas de Calidad y Buenas Prácticas en los productos farmacéuticos, biotecnológicos y en alimentos se ha mantenido como un campo abierto de investigación-desarrollo.

Así se han desarrollado diversos métodos como es el denominado “Gel Clot” que consiste en un ensayo cualitativo de detección de endotoxinas.

Cuando se requiere hacer un estudio cuantitativo de la presencia de endotoxinas bacterianas se aplica el método Cinético Turbidimétrico (KTA, por sus siglas en inglés), resultando ser el más sensible de los ensayos de LAL, teniendo sensibilidades tan bajas como 0.01 UE/ml, mención particular reclama su bajo costo, rapidez y la alta sensibilidad. En este ensayo la respuesta de activación es directamente proporcional con la concentración de endotoxina presente en la muestra, midiéndose mediante un espectrofotómetro a través de una reacción subsiguiente con un sustrato.

Al método Cinético Turbidimétrico (KTA) le ha seguido el uso de sustancias cromógenas que se colocan en un lector de placas con incubadora y se monitorea el desarrollo de un color amarillo a través del tiempo. Sin embargo algunos autores señalan que este método resulta más engorroso y consume más tiempo que el método de lectura de punto final.

También han sido desarrollados otros métodos como los cromatográficos (HPLC) y electroforéticos (SDS-Page) que han resultado engorrosos, lentos, y que no modifican las excepcionales virtudes de LAL. Otros métodos han utilizado ELISA (Enzyme-LinkedImmunoabsorbentAssay). Este método se basa en determinar la concentración residual de coagulógenos que no han reaccionados con los lipopolisacáridos presentes en la muestras En estos encontramos la necesidad de utilizar anticuerpos monoclonales que resultan ser altamente costosos aunque tienen como gran ventaja el bajo volumen de muestra necesaria.

Esto hace considerar que el método Cinético Turbidimétrico (KTA) para determinar LAL no ha perdido vigencia, más sin embargo nuevos retos, como siempre sucede en la ciencia, acechan su desempeño. En la actualidad existe una corriente creciente de aplicar la nanotecnología a las ciencias médicas, y en particular en el tratamiento del cáncer, entre otras razones al poder disminuir las dosis de los activos. Una de los nuevos problemas surge al encontrar que algunas nanopartículas se contaminan con lipopolisacáridos, pero lo apremiante consiste en que las determinaciones de endotoxinas bacterianas con LAL dan falsos positivos con algunos de estos sistemas de nanopartículas, que se esclarece cuando se aplica las técnicas de RPT (Rabbitpyrogen test).

Estos y otros desafíos están presentes en este apasionante tema.

PRODCUTOS UTILIZADO EN EL MÉTODO LAL

Kit de 100 PYROSTAR ES-F	Toxinómetro ET-6000 Series	Agua reactivo LAL (LRW)