¿En qué se diferencian entre sí los reactivos recombinantes para la prueba LAL?

Los reactivos recombinantes disponibles en el mercado se presentan actualmente en dos tipos: factor C recombinante (rFC) y reactivo recombinante en cascada (rCR). Las monografías de las farmacopeas estadounidense, japonesa y europea aceptan tanto los métodos rFC como rCR como alternativas al LAL, pero sigue siendo necesario realizar pruebas de adecuación basadas en la aplicación.

Los productos farmacéuticos, incluidas las vacunas, pueden estar contaminados por endotoxinas, que son lipopolisacáridos termoestables procedentes de bacterias gramnegativas. Las propiedades pirogénicas de las endotoxinas obligan a realizar pruebas de endotoxinas en los productos farmacéuticos parenterales para evitar reacciones fisiológicas graves en los pacientes. Actualmente, el método más utilizado para realizar estas pruebas es el ensayo con lisado de amebocitos de Limulus (LAL), derivado de animales. Sin embargo, se han sugerido como alternativas ensayos que utilizan factores recombinantes, un reactivo no derivado de animales [1] , y se han propuesto como métodos para su aceptación en las farmacopeas [2].
Los reactivos recombinantes disponibles en el mercado se presentan ahora en dos tipos:

• Factor C recombinante (rFC)
• Reactivo de cascada recombinante (rCR).

Aunque las monografías de la Farmacopea Japonesa, la Farmacopea de los Estados Unidos y la Farmacopea Europea aceptan tanto los métodos rFC como rCR como alternativas al LAL, sigue siendo necesario realizar pruebas de adecuación basadas en la aplicación [2]. 

Factor C recombinante (rFC) 

La Farmacopea Europea y la Farmacopea de los Estados Unidos reconocen los ensayos rFC como método oficial. Los reactivos del factor C recombinante (rFC) se componen únicamente del componente del factor C recombinante de la cascada de coagulación. Esta prueba utiliza un método fluorométrico de punto final [2]. Los métodos descritos en la Farmacopea Europea 2.6.32 y la Farmacopea de los Estados Unidos <86> para el rFC son la descripción de este método fluorescente de punto final. 

Reactivo recombinante en cascada (rCR) 

La Farmacopea de los Estados Unidos reconoce el rCR como método oficial. La reacción en cascada de tres zimógenos de proteasa y un coagulógeno es la base del mecanismo molecular para la coagulación de la hemolinfa por endotoxina. La cascada comienza con la activación del zimógeno (factor C) por la endotoxina. La activación del factor C desencadena la activación del factor B.

El factor B, además de su función conocida en la cascada de coagulación (transmitir señales del factor C), también se une a la endotoxina. La activación progresiva amplifica las señales, lo que aumenta la sensibilidad. La actividad proteasa del rCR, que contiene factor C recombinante, es significativamente mayor que la del factor C recombinante solo, lo que demuestra la amplificación sustancial de la señal que se logra mediante la reacción en cascada.
La enzima procoagulante es la tercera enzima añadida que proviene del genoma de Limulus polyphemus.
Se añade un cromóforo que se activa por la enzima coagulante, al igual que forma parte del reactivo cromogénico LAL.
La metodología de ensayo rCR es similar a las técnicas fotométricas cuantitativas (cromogénicas cinéticas) descritas en la Farmacopea de los Estados Unidos, USP <85>. La capacidad de realizar mediciones cinéticas permite medir sensibilidades más bajas, equivalentes a los reactivos del ensayo cinético cromogénico (KCA) de la USP <85>. Las mediciones cinéticas suelen permitir una sensibilidad más precisa y un rango de cuantificación más amplio, ya que pueden adaptarse a los múltiples tiempos de activación de muchas concentraciones estándar. 

PYROSTAR™ Neo +: Una alternativa superior basada en el rCR 

Las proteínas recombinantes ofrecen un método sostenible y exento de animales para la producción en masa, lo que elimina las preocupaciones éticas y las limitaciones en las escalas de producción. [3]
Nuestro nuevo reactivo PYROSTAR™ Neo+, una proteína recombinante, utiliza el ensayo cromogénico cinético (KCA) para detectar los niveles de endotoxinas bacterianas gramnegativas. Este reactivo es una solución integral para ensayos LAL, que incorpora el factor C y el factor B recombinantes, la enzima procoagulante (componentes esenciales del LAL), un sustrato cromogénico y una solución buffer adecuada. Un sustrato cromogénico permite la medición cuantitativa de los niveles de endotoxinas, reflejando el proceso del método LAL tradicional y proporcionando un resultado numérico preciso.
Además, el sistema PYROSTAR Neo+ demuestra una disminución en la interferencia de ciertos medicamentos y muestra una mayor sensibilidad a las endotoxinas naturales, lo que amplía su aplicabilidad a una gama más amplia de muestras y usos, como la evaluación de la seguridad de los productos y el análisis de los materiales farmacéuticos y el agua utilizada en su producción.

Referencias

1. Marius, M., Vacher, F. & Bonnevay, T. (2020). Comparison of LAL and recombinant Factor C endotoxin testing assays in human vaccines with complex matrices. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 74: pdajpst.2019.010389.
2. USP (2025). Chapter <86> Bacterial Endotoxins Test using Recombinant Reagents.
3. Kang, D.H., Yun, S.Y., Eum, S., Yoon, K.E., Ryu, S.R., Lee, C., et al. (2024). A Study on the Application of Recombinant Factor C (rFC) Assay Using Biopharmaceuticals. Microorganisms, 12(3): 516.