Revisión de las regulaciones por diferentes farmacopeas y los esfuerzos de unificación para la nueva generación de pruebas de pirógenos y endotoxinas (rFC, rCR y MAT)

Los avances científicos de las últimas décadas han facilitado la transición a nuevas tecnologías que no utilizan animales, MAT, rFC y rCR, representan metodologías de vanguardia en las pruebas de pirógenos de nueva generación. La Farmacopea de los Estados Unidos ha incluido el uso de rCR, RFC y MAT en sus normativas. Sin embargo, la Farmacopea Europea sólo ha incluido MAT y rFC en sus normativas. 

La detección de pirógenos es una medida de seguridad vital en la fabricación de productos farmacéuticos inyectables. Estos contaminantes, clasificados como endotoxinas y presentes en la membrana externa de la pared celular de las bacterias gramnegativas, pueden causar fiebre grave o shock tóxico si se administran por vía intravenosa. Es importante señalar que los pirógenos no endotoxínicos también suponen una amenaza significativa, comparable a la de las endotoxinas. 

Entre los años 1940 y 1970, la industria farmacéutica recurrió a los conejos para detectar endotoxinas, lo que provocó la muerte de un gran número de animales.[1] 

Sin embargo, en la década de 1970, surgió un nuevo enfoque para la detección de endotoxinas, utilizando la hemolinfa de los cangrejos herradura. La prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) se basa en la interacción entre los amebocitos y los contaminantes bacterianos. Este método está ampliamente reconocido como la norma internacional para la detección de endotoxinas. En los últimos años, la demanda de metodologías de ensayo sostenibles ha sido una tendencia creciente en todos los campos científicos. FUJIFILM ha aumentado significativamente su dedicación a la protección de estos notables animales mediante colaboraciones con varios grupos y organizaciones de conservación ecológica. Esto incluye el apoyo al Fondo para la Conservación del Cangrejo Herradura, que se dedica a la conservación a largo plazo de estos cangrejos mediante iniciativas comunitarias y divulgación educativa. 

Factor C recombinante (rFC) y reactivo de cascada recombinante (rCR) 

El genoma del cangrejo herradura se ha utilizado recientemente para desarrollar proteínas recombinantes de la cascada natural de LAL, que son componentes clave en los reactivos rFC y rCR (por ejemplo, PYROSTAR™ Neo+). A diferencia de los reactivos LAL de origen natural, estos reactivos alternativos ofrecen ventajas como evitar la variabilidad lote a lote y minimizar los falsos positivos de la vía de coagulación del (1→3)-β-D-glucano. Además, el uso de reactivos recombinantes promueve pruebas de endotoxinas sostenibles, alineándose con los principios de reemplazo, reducción y refinamiento para el bienestar animal.[4] 

En septiembre de 2019, el Comité de Expertos en Microbiología de la USP propuso ediciones al capítulo <85> acordado de pruebas de endotoxinas bacterianas USP-NF, que incluían la adición de reactivos de LAL recombinante al capítulo; sin embargo, esta propuesta fue rechazada. Otras propuestas fracasaron, como la adición de un capítulo consultivo, <1085.1>, dejando los reactivos de LAL recombinante (rLAL) como métodos alternativos. En 2022, se disolvió el Comité de Expertos en Microbiología de la USP, y se eligió un nuevo comité que volvió a reunirse en 2023. Tras la llegada de un nuevo comité de expertos en 2023, FUJIFILM Wako lanzó el paquete de validación interna PYROSTARTM Neo+ para ayudar a la validación del método. Ese mismo año, el comité de la USP redactó el capítulo <86>, que incluye los reactivos rFC y rCR. La USP votó en julio de 2024 a favor de incluir USP <86> en la publicación de 2025 tras un periodo de comentarios públicos. En mayo de 2025, el capítulo <86> se incluyó oficialmente en USP-NF 2025 Edición.[5] 

En cuanto a la aplicación de reactivos recombinantes en cascada (rCR), es importante señalar que la sección 2.6.32 de la Farmacopea Europea, que enumera los reactivos de Factor C recombinante (rFC) como método compendiado para la prueba de endotoxina bacteriana (BET), no aborda ni ofrece orientación específica sobre el uso de reactivos rCR. Como resultado, en Europa, el método rCR se considera una alternativa no farmacopeica.[6] 

Prueba de activación de monocitos (MAT) 

En la prueba MAT se utilizan células humanas, lo que permite una mayor relevancia fisiológica. Además, donde LAL sólo prueba la contaminación de endotoxina, MAT considera también la contaminación por pirógenos no-endotoxina (NEPs).[7] La mayoría de los kits MAT disponibles comercialmente utilizan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para realizar una prueba ELISA. Las variaciones entre los lotes de PBMC son comunes, y el tiempo medio de realización de la prueba es de dos días debido a la necesidad de cultivo celular, ELISA, y múltiples pasos de pipeteo y lavado. 

En cambio, el Kit de detección de pirógenos LumiMAT™ de FUJIFILM detecta pirógenos mediante un novedoso ensayo de gen indicador NF-κB. El ensayo del gen indicador NF-κB ofrece varias ventajas, como la ausencia de ELISA, la facilidad de manejo y la reducción significativa del tiempo de reacción debido a la eliminación de la necesidad de esperar a la liberación de IL-6. LumiMAT™ puede proporcionar resultados precisos en menos de la mitad del tiempo que los kits MAT tradicionales, utilizando una lectura de luminiscencia en lugar de la metodología ELISA tradicional. 

La Dirección Europea de Calidad del Medicamento y de los Servicios Sanitarios, el Consejo de Europa y la Asociación Europea para Enfoques Alternativos a la Experimentación con Animales (EPAA) colaboraron en una conferencia internacional titulada “El futuro de los ensayos de pirogenicidad: eliminación progresiva del ensayo de pirógenos en conejos”. El objetivo de la conferencia era mostrar la estrategia de la Farmacopea Europea para eliminar el ensayo de pirógenos en conejos (RPT) de sus textos antes de 2026, racionalizar la aplicación de las pruebas de activación de monocitos (TMA) e identificar las deficiencias en la erradicación del RPT.[8] 

La FDA reconoció el uso potencial de la MAT después de la validación específica del producto en 2009, publicando posteriormente directrices en 2009 y 2012 que incluían su posible uso para productos regulados por la FDA como dispositivos médicos, siempre que se validaran. El capítulo general sobre pirógenos de la Farmacopea de los Estados Unidos permite sustituir la prueba de pirógenos en conejo (RPT) por una prueba validada in vitro de pirógenos o endotoxinas bacterianas, según la USP 2018.[9] 

El proceso de validación deberá incluir diferentes pruebas, como el rastreo de interferencias y las pruebas de idoneidad del método, al tiempo que se garantiza la validación de las competencias del analista y del laboratorio para el ensayo.[10] 

Referencias:

1. HealthCare, E.D.f.t.Q.o.M., Ph. Eur. bids adieu to rabbit pyrogen test in its monographs. 2024.
2. Levin, J. and F.B. Bang, Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb Diath Haemorrh, 1968. 19(1): p. 186-97.
3. Pharmacopoeia, U., US Pharmacopoeia—National Formulary [USP 40 NF 35]. vol. 1. Rockville, Md, United States Pharmacopeial Convention. 2017, Inc.
4. Kelley, M., et al., A Demonstration of the Validation Process for Alternative Endotoxin Testing Methods Using PyroSmart NextGen® Recombinant Cascade Reagent. BPB Reports, 2023. 6: p. 68-75.
5. Rockville, USP provides guidelines for Recombinant Factor C (rFC) a non-animal-derived reagent critical to development of vaccines and other sterile pharmaceutical products. usp, 2020.
6. Carmen Marín Delgado de Robles (Roche Basel-Kaiseraugst), D.L.S.G., Evelyn Der (Genentech), Endotoxin testing: the international regulatory landscape. European Pharmaceutical Review, 2024.
7. Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.
8. Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p. 101702.
9. Allen, D., et al. Using the Monocyte Activation Test for medical devices. in NICEATM poster: SOT 2019 Annual Meeting. 2019.
10. Sandle, T., FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.