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¿Cuáles son las diversas aplicaciones del método LAL?

13th June 2014

Diversas aplicaciones del método LALEn www.wakopyrostar.com podemos encontrar diversos productos para realizar la detección de endotoxinas bacterianas mediante la aplicación de la técnica de LAL (Limulus amebocyte lysate).

La técnica del lisado de amebocitos de Limulus se utiliza para múltiples aplicaciones en investigación y en la industria. En este artículo describiremos algunas de estas aplicaciones.

Las endotoxinas bacterianas son lipopolisacáridos (LPS) que constituyen la membrana externa de las bacterias Gram negativas y son liberadas al medio cuando ocurre la lisis celular. Estas endotoxinas son sumamente tóxicas en los mamíferos incluyendo al hombre, por lo que determinar su presencia se convierte en un objetivo de gran importancia médica y social.

Origen de la técnica de LAL

En el año 1956, un investigador estadounidense llamado Frederick B. Bang observó que los cangrejos Limulus polyphemus, con los cuales estaba realizando una investigación, morían a causa de infecciones con bacterias Gram negativas, incluso si estas bacterias ya no estaban vivas. Posteriormente junto con Jack Levin, Bang continuó estudiando este fenómeno y descubrieron que la hemolinfa del cangrejo se coagulaba en contacto con las endotoxinas.

A principios de la década de los 70 , James F. Cooper fue el primero en aplicar la técnica de LAL para la determinación de endotoxinas bacterianas en una formulación parenteral. En la muestra de radiofármacos, de corta vida media, no podía ser evaluada evaluada la presencia de LPS por el método de detección de pirógenos en conejos que era el que se usaba en esos momentos. El método de pirógenos en conejos tiene la desventaja de que es largo, en este caso el ensayo en conejos consumía más tiempo que el de vida media de los radiofármacos. Con este ensayo llevado a cabo por Cooper se demostró que la técnica de LAL podía sustituir al método que usaba los conejos y además resultó ser al menos 10 veces más sensible. El método de LAL comenzó a imponerse en la industria y los laboratorios de investigación por ser más rápido, consumir menor volumen de muestras y ser más específico para endotoxinas bacterianas.

En el año 1977 ya se reportó la primera aplicación de la técnica de LAL usando el método cromogénico de detección. ( Nakamura, S., T. Morita, S. Iwanaga, M. Niwa, and K. Taka- hashi. 1977. A sensitive substrate for the clotting enzyme in horseshoe crab hemocytes. J. Biochem. 81:1567-1569. ) Aunque no fue hasta 1984 que Urbaschek y colaboradores describieron un método cromogénico cinético que permitía realizar la detección de endotoxinas a partir de los datos de los cambios de color ocurridos durante una hora. (Urbaschek, B., B. Ditter, K.-P. Becker, and R. Urbaschek. 1984. Protective effects and role of endotoxin in experimental septi- cemia. Circ. Shock 14:209-222.) Estos primeros métodos reportados tenían como desventajas que la determinación se realizaba en múltiples pasos, en ocasiones solo funcionaban para bajas concentraciones de endotoxinas y tenían rangos de detección muy limitados. Todos estos problemas se han resuelto y ya hay en el mercado productos como el Test Limulus Color KY de Wako que permiten hacer la detección de endotoxinas de manera cuantitativa y con gran precisión basándose en el método colorimétrico.

Aplicaciones del ensayo de LAL en la industria farmacéutica

Entre las aplicaciones más conocidas e importantes del ensayo de LAL están las relacionadas con la industria farmacéutica. Se puede decir que los pirógenos más frecuentes en los productos farmacéuticos son las endotoxinas, por lo que el ensayo de pirógenos en conejo ha sido sustituido por el ensayo de LAL según recomendaciones de las farmacopeas internacionales. Una de las causas que ha hecho que el ensayo de LAL se imponga en la industria farmacéutica es la recomendación de evitar el uso de animales vivos en los ensayos, hecha por diferentes organizaciones. Es importante aclarar que los cangrejos a los que se les extrae parte de la hemolinfa usada para el ensayo de LAL continúan con vida y sin ninguna secuela después de la extracción.

Por su efecto farmacológico ciertos citostáticos, corticoesteroides, algunos sedantes, derivados de la fenotiazina, antipiréticos y anestésicos, entre otros, no resulta factible detectar la presencia de LPS por el método en conejos, puesto que enmascaran el potencial pirogénico de las muestras. En estos casos el ensayo de LAL ha servido para poder realizar la detección de endotoxinas sin ningún inconveniente. Además existen trabajos de investigación, como el de Morote y col. que señalan la utilidad de aplicar las determinaciones de endotoxinas bacterianas mediante el ensayo de LAL en agentes de radiodiagnóstico y radioisótopos usados en análisis clínicos.(Morote, et al., Congreso de la Asociación Latinoamericana de Sociedades de Biología y Medicina Nuclear, Lima (Perú); 26-30 Oct. 1997.)

Para uso en investigaciones relacionadas con fármacos Wako pone a la disposición de los investigadores el kit PYROSTAR™ ES-F, con el que se puede determinar cuantitativamente la presencia de las endotoxinas mediante el método turbidimétrico cinético con un lector de placas que puede venir incluido en el kit o con el Toxinómetro™ y su software correspondiente. También Wako cuenta con otros productos para la detección cuantitativa de endotoxinas bacterianas como el Test Limulus ES-II, basado en el método de detección Gel-Clot. En estos kits se adiciona una alta concentración de β-1,3-glucano, un polisacárido que a bajas concentraciones actúa como interferente en la determinación de endotoxinas bacterianas.

Aplicaciones en control de calidad del agua y alimentos

Algunas bacterias Gram negativas forman parte de los sedimentos marinos, por lo que es importante controlar la calidad del agua para descartar la presencia de toxinas. Otra aplicación reportada por Jorgensen y colaboradores para el ensayo de LAL está relacionada con la evaluación de la calidad de agua de consumo humano. También se ha usado este método en el contros de calidad de las aguas residuales después de tratadas.

En la industria alimentaria el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus se utiliza para el control de la calidad de la carne cruda y de derivados cárnicos; de la leche y productos lácteos; los pescados y una gran variedad de alimentos. Existen muchos métodos para el control bacteriano en alimentos, pero una de las ventajas del ensayo de LAL es que se ha automatizado y existen en el mercado productos como el toxinómetro de Wako, que permiten realizar las determinaciones en corto tiempo como requiere en muchas ocasiones la investigación con productos alimenticios.

Otras aplicaciones

Entre otras aplicaciones del ensayo de LAL encontramos la evaluación del shock séptico realizada por investigadores en el estudio de diversas cepas de bacterias Gram negativas. También se utiliza el lisado de amebocitos de Limulus en investigaciones relacionadas con la industria cosmética e incluso se han reportado trabajos donde se usa el ensayo de LAL para estudiar la población bacteriana en estaciones orbitales.

PRODUCTOS PARA DETECCIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Ensayo de Limulus PS Pyrostar ES-F Plate con CSE  Kit KY color Limulus
Ensayo de Limulus PS Pyrostar ES-F Plate con CSE Kit KY color Limulus

Lisa
By: Lisa Komski In: Kit LAL