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Determinación de endotoxinas en plasma sanguíneo mediante el método de LAL

7th July 2015

Determinación de endotoxinas en plasma sanguíneo mediante el método de LALEl ensayo de LAL (Limulus amebocytes lisate o en castellano lisado de amebocitos de Limulus), como hemos comentado anteriormente en otros artículos de este blog, usa la hemolinfa del cangrejo herradura, Limulus Polyphemus, para la determinación de endotoxinas bacterianas. Las endotoxinas bacterianas son el pirógeno más frecuente que puede contaminar las muestras farmacológicas y de otros tipos. Estas endotoxinas bacterianas provienen de las bacterias Gram negativas que son muy abundantes en la naturaleza, de aquí que sea muy común encontrar estos lipopolisacáridos en cualquier medio.

La presencia de endotoxinas bacterianas en el plasma sanguíneo, como evidencia de la destrucción de la pared celular de bacterias Gram negativas, se ha relacionado con la posibilidad de formación de adenomas precursores del cáncer colorectal, así como de otros tipos de cáncer y diversas enfermedades producidas debido al desequilibrio de la microbiota del tracto gastrointestinal. Los científicos han estudiado los efectos que puede tener una alta concentración de endotoxinas bacterianas en el plasma sanguíneo, llegando a la conclusión que estas sustancias al unirse con las proteínas de unión de LPS forman el complejo CD14 que a su vez activa receptores que provocan respuestas inflamatorias innatas. Al producirse estos procesos se activan monocitos y macrófagos y se segregan citocinas proinflamatorias, como son el factor alfa de necrosis tumoral y distintos tipos de interleucinas, de aquí que una abundancia de bacterias Gram negativas en la microbiota intestinal pueda conducir a la formación de moléculas responsables de la proliferación celular y el daño del ADN que dan lugar a la formación del cáncer. La detección de lipopolisacáridos (LPS) en el plasma sanguíneo, así como en otras muestras biológicas y de laboratorio, puede llevarse a cabo mediante el método de LAL.

Otra utilidad que tiene la detección de endotoxinas bacterianas en el plasma sanguíneo es el estudio del paso del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) a la enfermedad que provoca este virus conocida como SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Se considera que la activación de este virus trastorna la inmunidad intestinal y causa la translocación microbiana de los productos bacterianos, la forma en que puede medirse este proceso es a través de la determinación de LPS en el plasma sanguíneo. Mediante el ensayo de LAL se ha comprobado que las personas portadoras del virus de inmunodeficiencia humana presentan niveles mayores de endotoxinas plasmáticas, hecho que concuerda con estudios realizados con primates donde también se ha observado que estos animales cuando portan el virus de inmunodeficiencia de simios poseen altos niveles de LPS en sangre.

Para llevar a cabo el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus en el plasma sanguíneo se utiliza el método colorimétrico. Se puede cuantificar la gelificación que se produce en la hemolinfa del cangrejo herradura por la presencia de endotoxinas bacterianas usando un colorante como es la para nitroanilina unido a una molécula de péptido. El enlace que se produce entre el péptido y la p-nitroanilina se rompe debido a la cascada de reacciones enzimáticas que desencadenan los LPS en la hemolinfa, que tiene como producto final la coagulina, proteína responsable de la formación del gel característico de esta reacción. La concentración de colorante en el medio se mide usando un espectrofotómetro y es proporcional a la cantidad de endotoxinas presentes en el medio. Las medidas de la concentración del colorante pueden realizarse a intervalos de tiempo fijos una vez que se ha añadido el reactivo LAL a la muestra de plasma (que daría como resultado lo que se conoce como ensayo de LAL mediante el método cromogénico cinético) o realizarse solo una medida al finalizar la reacción enzimática y ya formado el gel (en este caso se estaría utilizando el método cromogénico de punto final).

LÉASE TAMBIÉN: Detección De Endotoxinas Mediante El Ensayo De LAL, Método Cromogénico

La División LAL de Wako comercializa un test para realizar el ensayo de LAL mediante el método colorimétrico llamado Test Limulus Color KY, con el que se pueden efectuar medidas cuantitativas de la cantidad de endotoxinas bacterianas que contiene una muestra.

Cuando el ensayo de LAL se realiza en plasma sanguíneo se colectan las muestras de sangre previamente en tubos que ya contienen una disolución de EDTA, que impide la coagulación de la sangre, y a continuación se centrifugan los mismos. Si los tubos van a ser almacenados antes de realizar el ensayo tienen que conservarse a temperaturas por debajo de los 70º, para prevenir errores en los resultados. Otro aspecto a tener en cuenta es que el plasma debe estar libre de glóbulos rojos que también son otros potenciales interferentes que de estar presentes en las muestras provocarían falsos resultados.

Bibliografía:

1) Kostic AD, Gevers D, Pedamallu CS, Michaud M, Duke F, Earl AM, Ojesina AI, Jung J, Bass AJ, Tabernero J, Baselga J, Liu C, Shivdasani RA, Ogino S, Birren BW, Huttenhower C, Garrett WS, Meyerson M, Genome Res., 22, 2, 292-298, 2012.

2) Atreya R, Neurath MF, Curr Drug Targets, 9, 5, 369-374, 2008.

3) Giorgi JV, Hultin LE, McKeating JA, Johnson TD, Owens B, Jacobson LP, Shih R, Lewis J, Wiley DJ, Phair JP, Wolinsky SM, Detels R, J Infect Dis., 179 (4), 859-870, 1999.

4) W4, 1999.

5) K, 2011.

ACCESORIOS PARA MÉTODO LAL

Agua reactivo LAL (LRW): Agua sin endotoxina Tubos de ensayo para técnicas de coágulos de gel (Gel-clot) Endotoxina estándar de control con CSE
Agua reactivo LAL (LRW) Tubos de ensayo para técnicas de Gel-clot Endotoxina estándar de control con CSE

Lisa
By: Lisa Komski In: Kit LAL