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El conejo y el cangrejo herradura

25th September 2014

El conejo y el cangrejo herraduraDurante aproximadamente 30 años el método LAL para la detección de endotoxinas fue precedido por la prueba de pirógenos en conejos.

Ya se ha brindado mucha información sobre los procedimientos y los detalles acerca de los ensayos de endotoxinas LAL, por lo que la prueba de pirógenos de conejos se ha desactualizado con el uso del procedimiento LAL. Los debates sobre la prueba de pirógenos en este blog nos brindarán una comparación y una perspectiva de por qué actualmente se prefiere la modalidad LAL para la determinación de endotoxinas.

Pero primero debemos hablar de pirexia. La pirexia, o fiebre, es el aumento de la temperatura corporal por encima del valor normal. Pirógeno es una sustancia que induce la pirexia. Las endotoxinas son nuestro pirógeno de principal interés debido a su efecto perjudicial sobre el cuerpo humano. La prueba de pirógenos en conejos es básicamente una prueba en la que se inocula un conejo con una muestra del producto para determinar la presencia o ausencia de pirógenos. Si un pirógeno está presente en la sustancia de la prueba, causará el aumento de la temperatura corporal del animal sujeto a evaluación por encima de la normal. Los conejos tienen respuestas de temperatura ante las endotoxinas similares a los seres humanos; por este motivo, son ideales como modelo en las pruebas de detección de pirógenos.

La Farmacopea de EE.UU. ofrece una descripción sobre la administración de la prueba de pirógenos. La solución de prueba se administra por vía intravenosa en la oreja del animal. La tasa de administración no debe exceder los 10 ml/kg durante 10 minutos. Todos los materiales, diluyentes y soluciones utilizados deben esterilizarse y liberarse de pirógenos. Se seleccionan conejos adultos y sanos y se albergan a una temperatura entre 20 y 30 grados Celsius, además de aislarlos de todo tipo de disturbio o excitación. Este punto se debatirá posteriormente ya que existen otras situaciones que podrían causar el aumento de la temperatura corporal. Un conejo solo puede estar sujeto a una solución de prueba una vez cada 48 horas y después de 2 semanas de haber aumentado la temperatura corporal por encima de los 0.6 grados Celsius por encima del valor normal. La temperatura basal del conejo se mide dentro de los 30 minutos anteriores a la prueba. No debe exceder los 39.8 grados Celsius. Los conejos utilizados para esta prueba en grupos deben tener una variación de temperatura de 1 solo grado entre sí. Los conejos se analizan en temperaturas similares a su hábitat y se los mantiene en ayunas durante toda la prueba, aunque en algunos casos pueden ingerir agua. La temperatura se mide a través de sondas rectales mientras que el conejo es retenido en su posición natural de descanso. Las soluciones de prueba se inyectan en una vena de la oreja después de ser calentadas de 35 a 39 grados Celsius. Las lecturas de temperatura se toman en intervalos de 30 minutos durante las siguientes 1 a 3 horas. En esta prueba se evalúan tres conejos por solución.

VEA TAMBIÉN: Aplicaciones del ensayo de LAL en la industria farmacéutica

Una prueba negativa consiste en un aumento de la temperatura del conejo menor a 0.5 grados Celsius. En consecuencia, la solución de la prueba se considera libre de pirógenos. Un aumento de temperatura de 0.5 grados o mayor exige la repetición de la prueba en 5 animales modelo más. Un resultado negativo es un aumento de temperatura de 0.5 grados o mayor en solo 2 de 8 conejos o si la temperatura total aumenta en los 8 conejos no excede 3.3 grados Celsius.

El límite de las endotoxinas se expresa como K/M. K es la dosis umbral de pirógenos tanto para seres humanos como para los conejos sometidos a la prueba. K tiene un valor de 5 EU/kg. M es la dosis máxima humana administrada por kilogramo en una hora. Las inyecciones intratecales tienen un valor K de 0.2 EU/kg.

Existen numerosas limitaciones en el uso de la prueba de pirógenos con conejos para determinar el contenido de endotoxinas. Las endotoxinas y los pirógenos son dos entidades totalmente diferentes. La endotoxina es una molécula ubicada en la pared celular de una bacteria gram negativa y es un tipo de pirógeno. Los pirógenos son cualquier sustancia que causa respuestas febriles tanto en seres humanos como en conejos y comprende muchas entidades distintas a las endotoxinas. Las micobacterias, los hongos y los virus que no contienen endotoxinas igualmente pueden causar reacciones febriles. Tenemos pirógenos endógenos, sustancias inherentes a nuestro sistema metabólico, que pueden producir fiebre. Tenemos interleucina que se sabe producen el aumento de la temperatura corporal durante la activación de la vía inflamatoria. Se sabe que las hormonas de la tiroides y los estrógenos regulan la temperatura corporal y pueden aumentarla o disminuirla según el nivel y la actividad hormonal. Existen pirógenos endógenos que al introducirse en el cuerpo humano producen una respuesta febril. Las bacterias, sus toxinas, las vacunas y otros organismos microbianos; como los hongos, los virus y los parásitos; producen fiebre. La sangre y los productos sanguíneos durante la transfusión pueden producir un aumento de la temperatura corporal. Los medicamentos que ingerimos pueden causar diferentes reacciones en el cuerpo, entre las cuales puede estar el aumento de la temperatura.

CONOZCA El impacto de las endotoxinas en el cuerpo humano

Muchas otras condiciones también pueden derivar en el aumento de la temperatura corporal. El ejercicio produce un aumento de los ritmos metabólicos. Un mayor flujo sanguíneo y un metabolismo celular acelerado provocan una fiebre transitoria. El estrés o el entusiasmo emocionales también pueden causar una respuesta similar. Un tumor benigno o maligno, con los requisitos de aumento del metabolismo y la liberación de sustancias pirógenas endógenas, puede derivar en episodios febriles. El control de la temperatura del cuerpo se regula por el hipotálamo y cualquier defecto o lesión en el hipotálamo y el sistema nervioso central puede alterar la regulación de la temperatura corporal.

Existen numerosos factores que pueden causar pirexia, pero también muchos factores que contribuyen con la variabilidad en la prueba de pirógenos con conejos. Se trata de un ensayo in vivo, en el que no hay especificidad para las endotoxinas bacterianas, sino una variabilidad especie a especie y una variabilidad entre sujetos del ensayo. Cuando se desarrolló la prueba de pirógenos con conejos para la determinación de endotoxinas se destacaron muchísimas limitaciones.

Al tratarse de una prueba in vivo, varios estudios mostraron que la exposición múltiple a las endotoxinas y los pirógenos producía intolerancia en los animales analizados. Con el paso del tiempo y después de numerosas pruebas, la respuesta febril del conejo disminuía. También se descubrió que la presencia de bacteria Legionella pneumophilia genera un poco de pirexia en conejos, aunque con el procedimiento LAL se detecta fácilmente. De hecho, se descubrió una diferencia de 1000 veces entre los resultados de los dos procedimientos para detectar la endotoxina Legionella. En julio de 1976 L. pneumophilia fue la bacteria responsable de causar una gran epidemia de neumonía entre los asistentes a la Convención de la Legión Americana en el Hotel Bellevue Stratford en Filadelfia, que dejó como resultado 182 casos y la muerte de 29 personas.

Los ensayos con conejos se determinaron como inadecuados para detectar sustancias pirógenas en productos de radioterapia, medicamentos de quimioterapia, esteroides, narcóticos y otras sustancias que tienen una probabilidad inherente de hacer reaccionar el sistema inmunológico humano y producir reacciones pirógenas incluso en ausencia de pirógenos bacterianos. Esta consecuencia podría derivar en muchos resultados de falso positivo. La prueba de pirógenos, además, es más costosa, rigurosa y consume más tiempo. El mayor obstáculo de este tipo de ensayo, sin embargo, es la incapacidad de cuantificar el nivel de endotoxinas en sangre.

Como dicen los cuentos de fábula, el conejo fue el más rápido y comenzó temprano. A diferencia de la prueba de pirógenos con conejos, los ensayos LAL comparan los conejos con cangrejos herradura, que, como las tortugas, son habitantes marinos de paso lento. La prueba de pirógenos se adaptó por la Farmacopea de EE.UU. a principios de la década de 1940, unos 30 a 40 años antes del uso del ensayo de endotoxinas LAL. Debido a las ventajas del procedimiento LAL en términos de costos, especificidad, menor variabilidad, conveniencia y la posibilidad de ser cuantificable, actualmente el ensayo LAL ha reemplazado a la prueba de pirógenos para detectar la presencia de endotoxinas bacterianas. Por lo tanto, en nuestro cuento, el cangrejo herradura superó por un amplio margen al conejo.

REACTIVOS PARA PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Endotoxina estándar de control (CSE) Bio Clean Series Kit de 100 PYROSTAR™ ES-F (5.2 ML) (sin CSE)
Endotoxina estándar de control (CSE) Bio Clean Series Kit de 100 PYROSTAR™ ES-F (sin CSE)

Lisa
By: Lisa Komski In: Kit LAL