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Eliminación y seguimiento de endotoxinas bacterianas de muestras biológicas

23rd June 2016

Eliminación y seguimiento de endotoxinas bacterianas de muestras biológicasLa eliminación de endotoxinas bacterianas de muestras biológicas es una práctica de rutina en muchos laboratorios de investigación. Las bacterias Gram negativas, de donde provienen las endotoxinas bacterianas, se caracterizan por su posibilidad de crecimiento en casi todas las condiciones y tipos de muestras en las que se realizan los ensayos en los laboratorios. Desde que se conoce la pirogenicidad de las endotoxinas bacterianas y las consecuencias que tiene en la salud de humanos y animales la exposición a las mismas, se vienen estudiando los diferentes métodos de separación de las mismas cuando se encuentran contaminando alguna muestra en los laboratorios.

El método más común para remover las endotoxinas de las disoluciones de fármacos parenterales es la filtración. Las endotoxinas bacterianas son lipopolisacáridos que se encuentran en diferentes estados de agregación como contaminantes: en forma de vesículas, de miscelas o del tipo detergente, solubles. Todas estas formas en que pueden estar asociadas las moléculas de lipopolisacáridos se consiguen eliminar usando filtros con diferentes tamaños de poros. Cuando se presenta el caso de que el soluto y los agregados de endotoxinas tienen un tamaño similar, se pueden vencer las interacciones supramoleculares entre las moléculas de lipopolisacáridos usando métodos como la extracción de cationes. Se ha demostrado que los cationes estabilizan las bicapas formadas por las moléculas de endotoxinas, donde la parte hidrofílica queda expuesta al medio y las cadenas hidrofóbicas en la parte interior de la miscela o vesícula. Estos agregados son estabilizados por cationes divalentes, como pueden ser los cationes calcio o magnesio presentes en disoluciones acuosas. Al extraer los cationes de las disoluciones se pueden eliminar las endotoxinas usando filtros que tengan un tamaño de poro que permita pasar el soluto e impida el paso de las endotoxinas contaminantes.

Un método útil para remover endotoxinas de muestras biológicas es la cromatografía de afinidad, que se utiliza comúnmente para muestras de proteínas. Esta técnica consiste en hacer pasar las disoluciones por un material adsorbente poroso con histidina inmovilizada o también se puede inmovilizar la polimixina B. Las endotoxinas tienen una gran afinidad por la histidina en un amplio rango de pH y temperaturas. Se han reportado casos donde usando este método cromatográfico se logra reducir de la concentración de endotoxinas derivadas de varios tipos de bacterias Gram negativas de 1000 a menos de 0,01 ng/mL de disolución acuosa. Esta tipo de separación se puede llevar a cabo, por ejemplo, en muestras que contienen factor de necrosis tumoral y lisozimas, con buenos resultados. Otros autores han comparado los métodos cromatográficos para extraer las endotoxinas de muestras que contienen proteínas con la separación por fases con el detergente Triton X-114. Mediante este procedimiento se logra una mayor recuperación de las endotoxinas en la fase que contiene el detergente que con la cromatografía de afinidad. Esta técnica resulta de mayor utilidad en procesos a grandes escalas, como puede ser la purificación de proteínas recombinantes.

Una sustancia biológica que ha llamado la atención de los investigadores para sustituir los polímeros sintéticos en los plásticos por una molécula que permita obtener materiales biodegradables y/o biocompatibles, es el poli(3-hidroxibutirato) o PHB. El PHB es producido por bacterias Gram negativas entre las que se pueden mencionar la Ralstonia eutropha, la Alcaligenes latus, y la Escherichia coli. recombinante. Por cualquiera de los procedimientos que se siguen para aislar el PHB sintetizado por las bacterias, las muestras se obtienen contaminadas con endotoxinas. Para reducir la cantidad de endotoxinas en las extracciones se reemplaza el método de extracción con cloroformo por la digestión con hidróxido de sodio. En este caso en concreto la separación de las endotoxinas es indispensable para poder usar el PHB en cualquier aplicación biomédica como pueden ser el diseño de envases para la liberación controlada de fármacos, la fabricación de hilos para suturas y el reemplazo de tejido óseo.

En todos los casos donde se necesita separar las endotoxinas de un medio en específico, los investigadores realizan el ensayo de LAL como método de seguimiento de la separación. El ensayo de LAL, o Lisado de Amebocitos de Limulus, se basa en la gelificación que ocurre en la hemolinfa del cangrejo herradura en presencia de las endotoxinas bacterianas. El proceso de gelificación puede ser medido cualitativa y cuantitativamente por turbidimetría, pues el gel provoca que aparezca turbidez en el medio. La empresa Wako a través de la marca PYROSTAR™, brinda una serie de reactivos y accesorios para realizar el ensayo de LAL.

Estos kits se pueden adquirir como pruebas únicas o como multi pruebas, según la necesidad de los investigadores. Por ejemplo el ensayo simple de Limulus PS es una prueba única donde mediante la absorción de las endotoxinas en Pyrosep™, resina con afinidad y selectividad por este tipo de sustancias se puede medir el contenido de las mismas en una muestra. A diferencia de otros kits para el análisis de LAL (Lisado de Amebocitos de Limulus) con el Limulus PS se pueden disolver las muestras no solubles en agua en disolventes orgánicos para realizar el ensayo, esta característica es una ventaja del producto pues en investigaciones de fármacos principalmente, en muchas ocasiones existe la necesidad de conocer la presencia de endotoxinas en disoluciones no acuosas del analito, por ser moléculas insolubles en agua. Un ejemplo donde es útil el ensayo de Limulus PS es en muestras de proteínas liposolubles.

Bibliografía:

1) K J Sweadner, M Forte and L L Nelsen, Appl. Environ. Microbiol. October 1977 vol. 34 no. 4 382-385.

2) Matsumae, H., et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, Volume 12, Issue 2, pages 129–140, (1990).

3) Shigui Liu, Rowel Tobias, Shannon McClure, Garth Styba, Qinwei Shi, George Jackowski, Clinical Biochemistry, 30, 6, 455-463, 1997.

4) Sang Yup Lee1, Jong-il Choi1, Kyuboem Han, Ji Yong Song, Appl. Environ. Microbiol., 65, 6, 2762-2764, (1999).

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Kit de reactivos LAL Accesorios para método LAL
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By: Lisa Komski In: Kit LAL