Métodos analíticos para la detección de endotoxinas bacterianas

Existen tres métodos analíticos para la determinación de endotoxinas bacterianas mediante el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, conocido por sus siglas como ensayo LAL. Estos métodos son el Gel-Clot, el turbidimétrico y el colorimétrico, que pueden llevarse a cabo de manera cualitativa o cuantitativa.

Método Gel-Clot

El método Gel-Clot o de gelificación mide la cantidad de gel formado como consecuencia de la reacción que ocurre en el lisado de amebocitos en presencia de endotoxinas. En la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus se suceden una serie de reacciones en cadena como respuesta a las endotoxinas que finalizan en la coagulación de las proteína coagulina, siendo esta una reacción fácilmente observable por la formación del gel en el tubo de ensayo. Para considerar que el ensayo de LAL ha dado un resultado positivo mediante el método Gel Clot, se invierte el tubo donde ha ocurrido la reacción y se comprueba que el gel formado se mantiene en separado de la mezcla después de este proceso. Esta forma de usar el método Gel Clot sería cualitativa y es muy útil para ensayos rápidos, in-situ, donde se necesita saber si una muestra está contaminada o no por bacterias Gram negativas. También existe la posibilidad de aplicar este método de manera semicuantitativa. Midiendo la cantidad de gel formado en el tubo de reacción, se puede calcular la cantidad de endotoxinas contenidas en la muestra.

Método Turbidimétrico

Como se mencionaba anteriormente, la reacción provocada por las endotoxinas bacterianas en la hemolinfa del cangrejo produce la aparición de proteínas sólidas, por lo tanto genera turbidez en la muestra. Este hecho se aprovecha para detectar la presencia de endotoxinas por turbidimetría, técnica espectrofotométrica con la que pueden obtenerse datos de medidas mediante el método del punto final o el método cinético. El método cinético turbidimétrico es el que se usa más comúnmente en la industria para el control de calidad de materias primas y productos finales, siendo el método de control de pirógenos recomendado por los organismos internacionales en la actualidad. Este método puede ser usado en gran variedad de matrices y tiene la ventaja de que puede medirse la cinética de la reacción, por lo que es más preciso que el método Gel Clot. Usando los accesorios y reactivos que comercializa la marca PYROSTAR™ se pueden hacer medidas de varias muestras de forma simultánea. El Toxinometer® ET-6000 Series permite leer en placas multipozos en un rango bastante amplio de concentración de endotoxinas y controlando la temperatura a la que se realiza el ensayo.

Método Cromogénico

El método cromogénico aplicado al ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) consiste en adicionar un reactivo desarrollador de color que permite realizar la cuantificación de endotoxinas midiendo la absorbancia de la muestra. El reactivo cromóforo que se usa en los test de LAL colorimétricos es la p-nitroanilina, que inicialmente se encuentra en una forma incolora, al estar unida a un péptido. Producto de las reacciones de las endotoxinas con el lisado de amebocitos se libera la p-nitroanilina de manera proporcional a la cantidad de endotoxinas que se encuentren en la mezcla. Estos procesos se aprovechar para usar los datos de absorbancia, construyendo una curva de calibración, para el cálculo de la concentración de endotoxinas. Al igual que en el método turbidimétrico, los análisis se pueden realizar por el método del punto final o por el método cinético, donde se tienen en cuenta los datos de la absorbancia de la muestra al cabo de diferentes tiempos después de añadido el lisado. Como en cualquier método cromogénico, hay que tener en cuenta que la muestra en estudio no presente interferencias en la zona de medida, cualquier molécula que absorba a longitudes de onda cercanas al máximo de absorción de la p-nitroanilina puede modificar los resultados del análisis. El Test Limulus Color KY de la marca PYROSTAR™ permite la detección cuantitativa de endotoxinas mediante el método colorimétrico.

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