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Métodos utilizados para detectar endotoxinas bacterianas

5th June 2014

Métodos utilizados para detectar endotoxinas bacterianasEn el proceso de creación de productos farmacéuticos y biotecnológicos se debe garantizar que no exista la contaminación con pirógenos.

Obviamente esto reclama que exista el control de tan importante indicador tanto en las materias primas a utilizar, durante el cumplimiento de las diferentes etapas del proceso de producción así como del producto terminado. 

Consecuencia de las endotoxinas bacterianas

La presencia de estas endotoxinas bacterianas, fundamentalmente lipopolisacáridos (LPS) consecuencia del metabolismo de bacterias Gram-negativas, puede dar lugar a manifestaciones febriles a concentraciones del orden de los 1-10 ng/kg de endotoxina, pero incluso conducentes en algunos casos a shock y finalmente a la defunción. Hay una extrensa diversidad de pirógenos, de los cuales están el ácido lipoteicoico; endotoxinas, ciertos virus, peptidoglicano, hongos, enterotoxinas y esteroides.

El método de detección

El método utilizado durante un período mayor a 40 años para detectar la presencia de pirógenos fue evaluar la respuesta febril en conejos, que ha permanecido sin modificaciones transcendentes y fue poco interrogada su efectividad. Actualmente, las instituciones reguladoras a nivel internacional ponen en exigencia el control de pirógenos a través del método LAL (Lisado de Amebocitos de Limulus). Dicho método es práctico, muy sensible, específico, y adicionalmente, muy rápido.

Y es lógico que así sea pues una de las grandes desventajas que muestra el ensayo de pirógenos en conejos es que sus resultados no están directamente relacionados con la presencia de endotoxinas bacterianas, sino con cualquier sustancia que ocasione una respuesta febril en el conejo. Pero a la inversa, cualquier fármaco que tenga acción sobre el centro regulador de la temperatura corporal afectaría el resultado de coexistir la presencia de endotoxinas que se encuentran exclusivamente en la membrana externa de la pared celular de las bacterias Gram-negativas y que son capaces de resistir tratamiento térmico, como es el caso de la esterilización por vapor. 

Tres métodos fundamentales

Para detectar la presencia de endotoxinas existen fundamentalmente tres métodos:

Para todos existe un propósito único: detectar la presencia de las endotoxinas.

Método de Gelificación

A grandes rasgos el método de gelificación o gel-clot consiste en la reacción entre la hemolinfa del cangrejo herradura en relación a las endotoxinas. Este se puede desarrollar de forma cuantitativa o semicuantitativa en forma de ensayo límite.

Método Turbidimétrico

Una variante basada en el principio del método turbidimétrico pero con características cinéticas resulta muy utilizado en la actualidad, es el denominado turbidimétrico cinético, que presenta el rango más amplio de detección entre los métodos conocidos. Para su ejecución se debe contar con el equipamiento necesario, en esencia el TOXINÓMETRO ET-6000 SERIES satisface las exigencias máximas para este tipo de prueba originalmente desarrolla por Levin y Bang en 1968.

Método Cromogénico

Los Métodos cromogénicos consisten en el uso de un sustrato cromogénico sintético sin color, compuesto por un péptido unido por la arginina C-terminal a una molécula que participa en la coagulación y ocasiona la liberación de la molécula de pNA con color amarillo, resultando, por lo tanto, proporcional a la concentración de endotoxinas en la muestra. Este método resulta costoso justamente por la necesidad de utilizar este sustrato cromogénicos, lo que limita su uso sistemático.

De este método se han desarrollado algunas variantes como son método cromogénico de punto final y el método cromogénico cinético. 

Zhang y col. han desarrollado un método basado en la obtención de un anticuerpo monoclonal contra péptido C del LAL, que es un fragmento de 28-amino-ácido de coagulógeno generando un nuevo microensayo de inmunoabsorción para la endotoxina.

Otros nuevos procedimientos están en desarrollo pero lo cierto es que se mantiene el valor y la vigencia del ancestral LAL.

REACTIVOS PARA DETECCIÓN DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Tubos de ensayo

 Endotoxina estándar de control Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F
Tubos de ensayo Endotoxina estándar de control Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F

Lisa
By: Lisa Komski In: Kit LAL