Principios en los que se basa el test de Limulus para la detección de endotoxinas bacterianas

25th February 2016

Principios en los que se basa el test de Limulus para la detección de endotoxinaEl ensayo de LAL o test de Limulus se utiliza para la determinación de endotoxinas bacterianas en una amplia variedad de muestras, tanto en los laboratorios de investigación como en las industrias. El principio de este test es el proceso de coagulación que se produce en la hemolinfa del cangrejo herradura (Limulus Polyphemus) en presencia de lipopolisacáridos. En este artículo se describe el proceso biológico y la manera en que se utilizó el mismo para el desarrollo del ensayo.

La coagulación de la hemolinfa del cangrejo herradura ocurre mediante una serie de reacciones en cascada similares a las de los mamíferos. Para que se active esta cascada de reacciones las proenzimas de proteasas de serina presentes en la hemolinfa reaccionan sucesivamente hasta provocar el proceso de gelificación. Una característica significativa de las reacciones de coagulación que ocurren en el cangrejo Limulus es que se activan con cantidades muy pequeñas de lipopolisacáridos (LPS), con concentraciones del orden de los picogramos de endotoxinas bacterianas que entren en contacto con la hemolinfa ya es suficiente para que se produzcan las reacciones. Estas reacciones tienen la función de inmovilizar los microorganismos patógenos, que mueren debido a sustancias antimicrobianas secretadas paralelamente y liberadas a la hemolinfa.

El hecho de que muchos de los precursores necesarios para que se formen los coágulos en la hemolinfa del cangrejo herradura se encuentran en la hemolinfa en forma de gránulos, los llamados amebocitos, fue aprovechado por los investigadores para desarrollar un método de análisis de endotoxinas bacterianas a partir de la extracción de hemolinfa del cangrejo. Este ensayo se conoce con el nombre de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), ya que precisamente se realiza un lisado de los gránulos para que en presencia de endotoxinas reaccionen en el medio del ensayo y se produzca la formación del gel. La gelificación es la señal analítica utilizada para la detección tanto cualitativa como cuantitativa de los LPS. Para realizar el ensayo se extrae con una jeringa una cantidad de hemolinfa de cada cangrejo y el animal es dejado en su medio.

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Si nos adentramos más en el proceso biológico que ocurre en la hemolinfa del cangrejo herradura en presencia de LPS vemos que se pueden separar una serie de procesos de activación de proenzimas a enzimas por proteólisis: - el LPS activa autocatalíticamente la reacción de la proenzima del factor C en su transformación a facto C activado; - el factor C a su vez activa al factor B; - el factor B convierte a la proenzima formadora del gel en enzima. La enzima de coagulación resultante es la encargada de anclar en el coagulógeno dos unidades peptídicas, formándose un gel insoluble. Esta molécula es similar al fibrinógeno en artrópodos.

La cascada de coagulación descrita anteriormente también se activa por el (1,3)-β-D-glucano, en este caso mediante la activación del factor G, que es otra proenzima de la serina proteasa, y que también provoca que se forme la enzima formadora del gel. Por esta razón se considera el β-D-glucano como un interferente del ensayo de LAL para la medición de endotoxinas. Los investigadores de Wako estudiaron que si se adiciona el curdlan en el medio donde se lleva a cabo el ensayo de endotoxinas mediante el método de LAL, se elimina la interferencia del (1,3)-β-D-glucano. En la división LAL de Wako se adiciona el curdlan carboximetilado en la mezcla de reactivos liofilizados que se preparan para los ensayos, como en el caso del test ES-F de Pyrostar y la serie Limulus PS, asegurándose de obtener resultados fiables en la determinación de LPS.

Podemos afirmar que el ensayo de LAL o test de Limulus es un método de ensayo sencillo y muy sensible para endotoxinas bacterianas, que es empleado en la actualidad como el más eficiente para la determinación de este tipo de sustancias. El método original se realizaba de manera cualitativa o semi cuantitativa: la presencia de endotoxinas se determina mediante la lectura de la formación de coágulo de gel después de la incubación de una muestra con el lisado de amebocitos a 37ºC durante 1 hora. Actualmente se han desarrollado métodos cuantitativos de gran eficacia que permiten conocer la cantidad exacta de endotoxinas bacterianas que contiene una muestra, como el Limulus Color KY, que se basa en el método colorimétrico.

Bibliografía:

1) Iwanaga S., Curr. Opin. Immunol. 5, 74– 82, 1993.

2) Levin J., Bang F.B., Bull. Johns Hopkins Hosp. 115, 265–274, 1964.

3) Iwanaga S., Morita T., Harada T., Niwa M., Takada K., Kimura T., Sakakibara S., Haemostasis 7, 183–188, 1978.

4) J. Kambayashi, et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 22, 2, 93-100, 1991.

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By: Lisa Komski In: Kit LAL