Reactivos LAL para uso en investigación

El ensayo de LAL (lisado de amebocitos de Limulus) se lleva a cabo en la industria para la detección de endotoxinas bacterianas y de pirógenos en general. Aunque no solo a nivel industrial se utiliza este ensayo, en los laboratorios de investigación también es necesario usar el ensayo de LAL cuando se necesita conocer si una muestra contiene endotoxinas bacterianas. En esos casos es importante contar con reactivos que puedan usarse en diferentes medios y se adapten a las condiciones del experimento que precise realizar el investigador. Con este fin la división LAL de la compañía Wako ha desarrollado una línea llamada PYROSTAR™ con kits de reactivos y todos los accesorios necesarios para realizar el ensayo de LAL.

DESTACADO: La determinación de endotoxinas bacterianas: ¿cómo evitar la contaminación de las muestras durante la manipulación?

La marca PYROSTAR™ incluye endotoxina estándar de control presentada en viales que contienen 500 ng cada uno de endotoxina procedente de una cepa de E. Coli, con una potencia definida de 10000 unidades. Esta endotoxina, una vez reconstituida, puede ser conservada en frío durante un mes. La endotoxina estándar puede ser usada para validar la sensibilidad de los reactivos LAL, así como los métodos de detección que vayan a ser utilizados en cada ensayo. Además la endotoxina estándar de control es importante en la preparación de controles de inhibición.

Los kits de reactivos de la división LAL de Wako permiten la determinación de endotoxina por los diferentes métodos analíticos que se usan en la fase de detección de este ensayo.

• Si se va a realizar el ensayo por detección a través del método cinético colorimétrico el test de Wako para este fin es el llamado Test Limulus Color KY, que permite la determinación cuantitativa de endotoxinas.

• Para usar el método de gel-clot, como método de detección de las endotoxinas está el Test Limulus ES-II de Wako, en este caso la aparición del gel puede dar una medida cualitativa de la presencia de endotoxinas o se puede cuantificar la cantidad de pirógenos presentes por el método turbidimétrico.

• En el caso de usar el Test Limulus ES-2 o el PYROSTAR™ ES-F / Plate Reagent la detección de endotoxinas se realiza mediante el método cinético turbidimétrico.

Estos kits de reactivos se venden en diferentes formatos, de 4 viales monodosis o de 100 viales monodosis, viales multitest para usar en microplacas y llevar a cabo análisis de varias muestras a la vez o viales de un solo ensayo, donde se realiza el procedimiento para medir en el mismo tubo donde viene la mezcla de reactivos. Todos ellos incluyen el curdlan carboximetilado que se adiciona a la mezcla de reactivos para eliminar la interferencia del β-1,3-glucano. El β-1,3-glucano es una sustancia que también provoca el comienzo de la cascada de reacciones que ocurre en la hemolinfa del cangrejo herradura cuando hay presentes endotoxinas y que posibilita que se realice el ensayo de LAL.

Además la división LAL ofrece a los investigadores agua libre de endotoxinas, pipetas libres de endotoxinas así como tubos de dilución. Todo este material es necesario para llevar a cabo el ensayo de LAL de manera fiable, pues las endotoxinas pueden estar contaminando cualquier material de laboratorio reutilizable, por lo que no es recomendable el uso de cristalería, tubos, ni pipetas que no estén certificadas como libres de endotoxina.

Un accesorio importante que complementa estos kits de reactivos y material de laboratorio de la línea PYROSTAR™ es el Toxinometer® ET-6000, que es un sistema computarizado de lectura de los tubos del ensayo de LAL. El Toxinometer® ET-6000 puede usarse con tres métodos de detección: el método gel-clot, el ensayo turbidimétrico cinético y el método cinético cromogénico. Pudiendo ofrecer los resultados de un mismo tubo de reacción por el método gel-clot y el método turbidimétrico cinético. Las ventajas que ofrece el uso del Toxinometer® es el menor riesgo de contaminación en comparación con las microplacas, la facilidad de manejo del software para el técnico encargado del análisis y que puede usarse tanto para reactivos de un solo uso como para los de múltiples usos. El Toxinometer® además tiene la posibilidad de comenzar un nuevo ensayo mientras otro se está realizando y de archivar las curvas estándar.

Bibliografía:

1) McCullough, K. Z., Pharm. Techno., 12, 5, 1988.

2) Cohen, J., and J. S. McConnell., J. Infect. Dis., 150, 916-924, 1984.

3) Thompson, M. et al., Pure Appl. Chem., 74, 5, 835-855, 2002.

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