Superando a interferência da amostra no teste LAL

O que é interferência da amostra?

A interferência da amostra ocorre quando uma substância ou um processo desenvolvido em uma amostra conduzem a resultados de teste incorretos. As consequências potenciais da interferência da amostra são sérias, incluindo uma interpretação de teste enganosa ou mesmo um diagnóstico incorreto. A interferência da amostra pode ser endógena e exógena. A interferência endógena ocorre devido às substâncias naturalmente presentes em uma amostra. A interferência exógena ocorre devido a substâncias ou processos externos, incluindo medicamentos, aditivos, componentes de tubos de coleta, etapas de processamento, formação de coágulos ou contaminação.¹ Devido às consequências negativas e potencialmente graves da interferência da amostra, o risco deve sempre ser considerado ao projetar e realizar testes.

O teste de lisado de amebócito Limulus (LAL)

O teste de amebócito Limulus (LAL) é empregado para detectar a presença de endotoxinas bacterianas em amostras analisadas. As endotoxinas são liberadas da membrana externa das bactérias gram-negativas principalmente após a lise bacteriana. Se as endotoxinas ganharem acesso parenteral ao corpo humano, elas podem levar à inflamação, febre, choque e até à morte.² O teste LAL é baseado na incubação de proteínas extraídas do sangue de caranguejos ferradura com uma amostra analisada. Se a endotoxina estiver presente na amostra, uma reação de coagulação se desenvolve.³ O coágulo pode ser visualizado qualitativamente, o que é designado como um teste de gel-coágulo. A quantificação da endotoxina pode ser realizada medindo a turbidez (um teste LAL turbidimétrico) ou por determinação colorimétrica em uma modificação da técnica de coágulo em gel (um teste LAL cromogênico).

Interferência da amostra no teste LAL e fatores de interferência

Em um estudo inicial, a possibilidade de interferência no teste LAL foi avaliada para 333 medicamentos. Se as amostras não foram diluídas ou tratadas de qualquer maneira, 236 (71%) desses medicamentos interferiram no teste.⁴ Uma variedade de fatores pode criar um risco de interferência da amostra no teste LAL, ativando a mesma cadeia de reações enzimáticas que o reagente LAL ou ativando outra via que leva à coagulação e turbidez. Fatores de interferência podem incluir a força iônica e o pH da mistura de reação, substâncias orgânicas com propriedades quelantes ou anticoagulantes, oxidantes ou outros compostos com propriedades desnaturantes enzimáticas, fatores de interferência que imitam a ação de endotoxinas (tais como (1→3) -β-D-glicanos, serina proteases e filtros de celulose) ou nanomateriais.^5,6 Além disso, compostos coloridos podem interferir com o teste cromogênico LAL.⁵ Existem várias estratégias para superar a interferência da amostra no teste LAL. Notavelmente, se os tratamentos da mistura de reagentes forem usados para reduzir a interferência da amostra, os testes modificados devem ser validados quanto à sua capacidade de detectar endotoxinas.⁵

Estratégias para redução da interferência da amostra no teste LAL^5,6

Diluição da amostra

Diluir amostras em um grau em que o fator de interferência não afeta mais os resultados do teste, mas a endotoxina ainda é detectável, é a estratégia mais amplamente aplicada para superar a interferência da amostra no teste LAL. A maior diluição, na qual a endotoxina pode ser detectada, é conhecida como a diluição máxima válida (MVD). Em muitos casos, a diluição da amostra é suficiente para superar a interferência da amostra e deve sempre ser tentada primeiro.

Manter uma faixa de pH ideal

O pH da mistura de reação deve ser mantido dentro de uma faixa ideal, que é mais comumente 6,0-8,0. No entanto, a faixa de pH específica para cada kit de teste LAL deve ser estritamente observada. A faixa de pH ideal pode ser alcançada pela capacidade de tamponamento do reagente LAL. Além disso, a diluição pode otimizar o pH da mistura de reação. Se essas medidas não forem suficientes, tampões específicos promovendo a faixa de pH ideal podem ser usados para reconstituir o reagente ou amostra LAL. Finalmente, a adição de um ácido ou base pode ajudar a ajustar o pH.

Correção de concentrações excessivas de cátions bivalentes

Cátions bivalentes, tais como Ca²⁺ e Mg²⁺, também podem influenciar a reação de LAL. Concentrações excessivas desses cátions podem neutralizar a carga negativa das endotoxinas, promover a agregação de endotoxinas, diminuir a atividade das endotoxinas e levar à inibição da reação. A diluição é geralmente usada para diminuir a concentração de cátions. Se isso for insuficiente, a ultrafiltração pode ser usada para separar a endotoxina e as substâncias interferentes. 

O significado da prevenção de interferência de amostra no teste LAL

O teste LAL é o teste mais amplamente utilizado para detecção de endotoxinas. No entanto, existem riscos de interferências na amostra e podem ter consequências deletérias. A diluição da amostra é normalmente tentada primeiro para superar a interferência da amostra e, em muitos casos, é o suficiente. Se esta abordagem não for bem sucedida, a otimização da faixa de pH e força iônica ou remoção de compostos interferentes pode ser empregada. No entanto, se os tratamentos da mistura de reação forem usados para superar a interferência da amostra, o teste modificado deve ser validado por sua capacidade de detectar endotoxinas

Fontes de literatura

1. Dimeski G. Interference testing. The Clinical Biochemist Reviews 2008; 29 (Suppl 1): S43–S48.
2. Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources 2018; 52 (2): 115–120.
3. Novitsky TJ. Biomedical applications of Limulus Amebocyte lysate. J.T. Tanacredi et al. (eds.), Biology and Conservation of Horseshoe Crabs, DOI 10.1007/978-0-387-89959-6_20, Springer Science+Business Media, LLC 2009.
4. Twohy CW, Duran AP, Munson TE. Endotoxin contamination of parenteral drugs and radiopharmaceuticals as determined by the Limulus amebocyte lysate method. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 1984; 38: 190–201.
5. Dawson ME. Interference with the LAL test and how to address it. LAL Update 2005; 22(3): 1–5.
6. Interfering factors in the LAL test. Fujifilm. https://www.wakopyrostar.com/blog/kit-lal/post/interfering-factors-in-the-lal-test/