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PYROSTAR™ ES-F Prueba vial única


PYROSTAR™ ES-F Prueba vial única

PYROSTAR™ ES-F

Prueba Vial única

Uso previsto: El Limulus amebocyte lysate (LAL) está diseñado para detectar endotoxinas bacterianas Gram-negativas. El PYROSTAR™ ES-F está diseñado para detectar cualitativamente las endotoxinas mediante coágulos de gel o detección cuantitativa por medio de métodos cinético turbidimétricos. El rango cuantitativo para el ensayo cinético turbidimétrico (KTA) se basa en la sensibilidad del lisado del coágulo de gel etiquetado. Consulte la tabla siguiente.

Sensibilidad del lisado del coágulo de gel etiquetado  (UE/ml)

Rango cuantitativo KTA (UE/mL)

0.015

0.001 a 10

0.03 a 0.25

0.01 a 10


Reference:
WPESK-0015

Resumen e información general

La endotoxina (lipopolisacárido o LPS) es un componente de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Puesto que las endotoxinas, cuando se inyectan o se implantan, pueden causar fiebre y/o shock, la detección de endotoxinas bacterianas en dispositivos farmacéuticos y médicos es crítica.

El ensayo LAL es el método más sensible para detectar endotoxinas bacterianas entre los actualmente aprobados por la FDA2. La primera metodología utilizada para determinar los resultados de la prueba LAL fue la formación de un coágulo de gel (gel-clot) en la parte inferior del tubo de reacción de vidrio. También se ha observado que la solución de prueba se vuelve turbia antes de la formación de gel. El tiempo requerido para producir un nivel específico de turbidez es inversamente proporcional a la cantidad de endotoxinas de la muestra1.

Se utiliza un instrumento fotométrico como el toxinómetro (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para medir la velocidad de cambio de la turbidez. En general, este procedimiento de medición cuantitativa se conoce como ensayo cinético turbidimétrico (KTA).

Mediante la utilización de estas propiedades, Wako Chemicals USA ha desarrollado una prueba de endotoxina LAL que puede utilizarse como prueba turbidimétrica cuantitativa o como prueba cualitativa de coágulo de gel.

La prueba de endotoxinas bacterianas USP <85>6 proporciona procedimientos estandarizados para la validación antes de su uso rutinario.

Sin embargo, la especificidad de LAL no es absoluta7. Se ha reportado que el LAL no sólo reacciona con endotoxina sino también con β-1,3-glucano. Aunque el sistema de cascada activado por β-1,3-glucano ha demostrado ser diferente al que activa la endotoxina8, el resultado final, la formación de coágulos de gel, es indistinguible.

La activación de LAL por glucano en una muestra puede prevenirse mediante la adición de una gran cantidad de curdlan carboximetilado (CMC) a LAL. La presencia de grandes cantidades de glucano no interfiere con la cuantificación de endotoxinas. Wako fue el primero que hizo uso de estos hallazgos mediante el desarrollo de un ES-buffer que contiene altas concentraciones de CMC. Cuando se utiliza el ES-buffer para reconstituir LAL, el reactivo LAL se convierte en específico para la endotoxina. PYROSTAR™ ES-F es una nueva preparación de LAL en la que el CM-curdlan se co-liofiliza con LAL. Reconstituir los viales para una prueba PYROSTAR ES-F con la muestra da como resultado un reactivo LAL específico para la endotoxina.

Historia y principio biológico

La detección in vitro de la endotoxina bacteriana fue iniciada por Levin y Bang3. Sus hallazgos mostraron que la sangre de cangrejo herradura, Limulus polyphemus, coagula en presencia de bacterias Gram-negativas. Posteriormente reportaron que todos los componentes necesarios para la formación del coágulo podían ser aislados de los amebocitos circundantes encontrados en la sangre de Limulus3,4.

La U.S. Food and Drug Administration (FDA) emitió una directriz en 19875 para informar a los fabricantes de medicamentos de uso humano y productos biológicos, medicamentos veterinarios y dispositivos médicos, sobre los procedimientos que la FDA consideraba necesarios para validar el uso del LAL como producto final para pruebas de endotoxinas. La pauta de la FDA se combinó con la prueba de endotoxinas bacterianas USP en el año 2000, haciendo del método USP el método estándar para los fabricantes en EE.UU. La directriz de la FDA de 1987 se retiró en 2011.

Advertencias y precauciones generales

El PYROSTAR™ ES-F está diseñado para la detección in vitro de endotoxinas bacterianas Gram-negativas. Tenga cuidado al manipular el LAL, ya que su toxicidad se desconoce.

Esta prueba no es un dispositivo de diagnóstico y no debe usarse para determinar los niveles de endotoxina en seres humanos para propósitos de diagnóstico.

Reactivos proporcionados

Reactivo PYROSTAR™ ES-F: PYROSTAR™ ES-F es un reactivo liofilizado que contiene Limulus amebocyte lysate, buffers, carboximetil curdlan, cationes monovalentes y divalentes.

  • Precaución: El vial para una prueba PYROSTAR™ ES-F se reconstituye mediante la adición de la muestra del producto o control en el tubo. Debe ser incubado inmediatamente después de la adición de la muestra del producto o el control.
  • Almacenamiento: Conservar entre 2 y 10 °C

Endotoxina estándar de control (CSE): Es un reactivo liofilizado que contiene endotoxina refinada a partir de E.coli y se utiliza para confirmar la sensibilidad del reactivo LAL, validar los métodos de prueba del producto y preparar controles de inhibición.

  • Preparación: Libere el vacío halando suavemente hacia arriba y quitando el tapón de goma del vial. El vial contiene 500 ng de endotoxina. Cada endotoxina estándar de control se prueba en comparación con la endotoxina estándar de referencia FDA y se determina el factor de conversión (UE/ng). El valor de UE (UE/vial) está impreso en la etiqueta. Determine el volumen de LRW que se añadirá al vial para producir una solución de 1,000 UE/ml. Adicione el volumen determinado de LRW al vial. Ponga nuevamente el tapón de goma, invierta el vial varias veces y agite girando vigorosamente durante 2 minutos.
  • Almacenamiento: La CSE reconstituida puede almacenarse a 2-10 °C durante 1 mes y no debe conservarse a temperaturas bajo cero. Cuando se utiliza la solución almacenada, agítela girando vigorosamente durante 1 minuto antes de usarla.

Materiales y equipo no proporcionados

Endotoxina estándar de referencia (RSE): Una endotoxina estándar de referencia USP que tiene una potencia definida de 10,000 unidades de endotoxina (UE) USP.

Agua reactiva a LAL (LRW): Agua sin endotoxina.

Pipetas sin endotoxina

Tubos de dilución sin endotoxina

Método con toxinómetro

  • Toxinómetro (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)
  • Tapas de aluminio sin endotoxinas

Técnicas de coágulos de gel (Gel-clot)

  • Baño de agua o calentador de tubos de ensayo capaz de mantener 37 ± 1 °C
  • Tapas de aluminio sin endotoxinas

Preparación de diluciones de endotoxina estándar de control

Preparación de endotoxina estándar de control

Con base en la información proporcionada en la Certificación de Análisis, prepare una CSE estándar con una concentración de 1000 UE/ml, como se describió anteriormente. Agite la solución CSE 1000 UE/ml durante 2 minutos a temperatura ambiente. Utilizando la solución de CSE 1000 UE/ml, prepare la serie de diluciones de endotoxina como se muestra en las Tablas 1 o 2.

Agite girando cada tubo durante 30 segundos entre las diluciones. Las diluciones se pueden preparar en diferentes volúmenes, siempre y cuando se mantenga la misma proporción.

                                         Tabla 1                                                                                               Tabla 2

                         Esquema de dilución para                                                                  Esquema de dilución para

                           muestra de endotoxina                                                                     muestra de endotoxina

                     (Serie de dilución de 2 veces)                                                           (Serie de dilución de 10 veces)

Conc. inicial de endotoxina (UE/ml)

Volumen añadido a LRW (ml)

Conc. final de endotoxina (UE/ml)

 

Conc. inicial de endotoxina (UE/ml)

Volumen añadido a LRW (ml)

Conc. final de endotoxina (UE/ml)

1000

0.4 + 3.6

100

1000

0.4 + 3.6

100

100

0.4 + 3.6

10

100

0.4 + 3.6

10

10

0.4 + 3.6

1

10

0.4 + 3.6

1

1

2.0 + 2.0

0.5

1

0.4 + 3.6

0.1

0.5

2.0 + 2.0

0.25

0.1

0.4 + 3.6

0.01

0.25

2.0 + 2.0

0.125

0.01

0.4 + 3.6

0.001

0.125

2.0 + 2.0

0.06

 

0.06

2.0 + 2.0

0.03

0.03

2.0 + 2.0

0.015

0.015

2.0 + 2.0

0.008

0.008

2.0 + 2.0

0.0039

 

 

Recolección y preparación de la muestra

Las reacciones LAL son sensibles al pH y requieren que la mixtura de la muestra LAL tenga un pH de 6.0 a 8.0. El PYROSTAR™ ES-F/Plate contiene componentes neutralizadores que ayudan a situar la mezcla de prueba dentro del intervalo de pH en la mayoría de los casos. Si es necesario adecuar el pH, éste debe ajustarse con HCl o NaOH sin endotoxinas.

Interferencia del producto

Antes de usar la prueba LAL para la entrega de rutina del producto, se requiere validar la ausencia de interferencia del producto mediante la realización de una prueba de inhibición/mejora para cada tipo de producto. Un producto se determina que no interfiere probando una muestra fortalecida del producto con una cantidad conocida de endotoxina y la detección de 50 - 200% de la endotoxina fortalecida.

Ensayo cinético turbidimétrico (KTA):

Prepare una curva estándar que cubra el rango de prueba. Fortalezca el producto a un nivel de endotoxina que sea igual o aproximado a la mitad de la curva estándar. Se determina que el producto no interfiere si el nivel de endotoxina reportado es 50 a 200% de la concentración de endotoxina fortalecida. Por ejemplo, si una curva estándar se realiza entre 0.1 y 10 UE/ml, el producto debe fortalecerse con endotoxina para producir una concentración de 0.1 UE/ml. La recuperación de endotoxinas aceptable se encuentra entre 0.5 y 2.0 UE/ml.

Técnicas de coágulos de gel:

Se preparan dos series independientes de dilución CSE usando el producto y LRW como diluyentes, respectivamente. Probar la serie de dilución preparada con CSE en LRW por duplicado (n = 2), y la serie de dilución preparada con CSE en el producto por cuadruplicado (n = 4). Los puntos finales de valoración media geométrica de las dos series de dilución deben estar dentro del doble de la sensibilidad a la endotoxina indicada en la etiqueta.

Procedimiento del ensayo cinético turbidimétrico

El ensayo cinético turbidimétrico (KTA) puede realizarse con el toxinómetro y su software asociado (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

Además de la prueba del producto, un ensayo válido incluirá estándares de endotoxinas que abarquen el rango de análisis, controles positivos del producto y controles negativos. Todos los valores de las pruebas deben determinarse a partir de, al menos, muestras duplicadas.

Método con toxinómetr:

Transfiera asépticamente 0.1 ml del reactivo PYROSTAR™ ES-F a los tubos sin endotoxinas del toxinómetro. Adicione 0.1 ml de cada muestra del producto o de control en los respectivos tubos de ensayo, comenzando con el control negativo y terminando con la concentración más alta de endotoxina. Después de cada adición de cada muestra del producto o control, mezcle rápidamente el contenido del tubo sin formar espuma. Ponga el tubo en el toxinómetro en el orden de la posición asignada al tubo. Al final del periodo de incubación, el software del toxinómetro efectuará un análisis de regresión de los datos de la curva estándar y calculará los niveles de endotoxina para cada muestra.

Consulte las “Pruebas de endotoxinas bacterianas” en la Farmacopea de EE.UU. y busque las secciones que describen la curva estándar y la preparación de soluciones6.

Cálculo de la concentración de endotoxina

Durante una reacción KTA el toxinómetro monitorea continuamente la turbidez de las soluciones de prueba. Se mide el tiempo requerido para que la muestra alcance un nivel de absorción determinado sobre el antecedente. Este tiempo se reconoce por el software del toxinómetro como Tg.

El software produce un registro log(eje x)/log(eje y) de correlación del Tg de cada estándar con su correspondiente concentración de endotoxina. A continuación se presenta un ejemplo de una serie estándar y la recuperación de una endotoxina fortalecida de 1.0 UE/ml en el producto.

Análisis representativo

Estándares

CSE (UE/ml)

Tg(min)

Log Concentración

Log Tg (min)

NC

0

NR

------

-------

STD1

10

8.0

1.0000

0.9031

STD2

1

13.2

0.0000

1.1206

STD3

0.1

23.6

-1.0000

1.3729

pendiente -0.2349

y-intercep 1.1322

coeficiente de correlación -0.999

 

Tg (min)

Log Tg (min)

Calculado EU/mL

% Recuperado

Producto 1

NPC1

NR

------

------

------

 

PPC1

13.6

1.134

0.987

98.7%

 

Producto 2

NPC2

NR

------

------

------

 

PPC2

13.0

1.114

1.196

119.6%

NR = No reactivo

En este ejemplo, el control positivo del producto (PPC) para cada muestra del producto producido por recuperación de endotoxinas en consonancia con el nivel fortalecido indica que no hay mejora ni inhibición detectables en el producto. El control negativo del producto (NPC) y el control negativo (NC) mostraron niveles significativamente más bajos de endotoxina que la menor concentración de endotoxina estándar.

Características de rendimiento

La linealidad de la curva estándar en el intervalo de concentración utilizado para determinar los niveles de endotoxinas debe verificarse. No menos de 3 estándares de endotoxina, que abarcan el rango de concentración deseado, y el agua estéril LRW deben ser analizados al menos por triplicado. Consulte la verificación de criterios para la curva estándar en USP. El valor absoluto del coeficiente de correlación, lrl, será mayor que o igual al valor 0.9806.

Procedimiento para las técnicas de coágulos de gel

Para asegurar la precisión y la validación de la prueba PYROSTAR™ ES-F, debe verificarse la sensibilidad indicada en la etiqueta según se describe en la prueba de endotoxinas bacterianas USP <85>6

Cada ensayo debe incluir NC (control negativo), 2λ PC (2λ CSE de control), 2λ PPC (2λ del producto de control positivo) y el producto que se va a probar.

1. Adicione 0.1 ml de PYROSTAR™ ES-F reconstituido a cada tubo de ensayo.

2. Transfiera asépticamente 0.1 ml de cada muestra de producto o de control a cada tubo de ensayo, comenzando con el control negativo y terminando con la concentración más alta de endotoxina.

3. Mezcle rápidamente el contenido de los tubos y proceda a incubarlos sin perturbaciones en un calentador o baño de agua a 37 ± 1 °C durante 60 ± 2 minutos.

4. Después de la incubación, examine cada tubo para verificar la gelificación. Cada tubo, en el método de coágulos de gel, se interpreta como positivo o negativo. La prueba positiva se define como la formación de un gel firme capaz de mantener su integridad cuando el tubo de ensayo se invierte 180°. La prueba negativa se caracteriza por la ausencia de gel o por la formación de una masa viscosa que no se mantiene cuando el tubo de ensayo se invierte.

5. Los resultados de la prueba sólo son válidos cuando el 2λ PC y 2λ PPC son positivos y NC es negativo.

Ensayo de endotoxina por series de dilución

La sensibilidad indicada en la etiqueta de PYROSTAR™ ES-F puede confirmarse mediante la preparación de una serie doble de diluciones de RSE o CSE (con una potencia confirmada) que abarque la sensibilidad establecida. La serie de dilución debe probarse por cuadruplicado e incluir controles negativos. Después se determina la sensibilidad calculando la media geométrica de los puntos finales obtenidos. A continuación se describe un ejemplo de PYROSTAR™ ES-F con una sensibilidad indicada de 0.125 UE/ml (λ):

Resultados del ensayo de coágulos de gel

Dilución de endotoxina (UE/ml)

Réplica

0.25

0.125

0.06

0.03

NC

End point

Log10 Punto final

1

+

+

+

-

-

0.06

-1.222

2

+

+

-

-

-

0.125

-0.903

3

+

+

-

-

-

0.125

-0.903

4

+

+

+

-

-

0.06

-1.222

Convierta cada punto final del ensayo por cuadruplicado a su valor log10. Los valores log10 individuales se promedian y la sensibilidad de PYROSTAR™ ES-F se toma como el antilog10 de este valor log medio. La media del valor log10 en el ejemplo anterior es -1.063 y la media geométrica (antilog10) es 0.087.

Determinación de endotoxina en solución desconocida mediante coágulos de gel

Para determinar la concentración de endotoxina en una solución desconocida, pruebe dos diluciones del producto hasta que se alcance un punto final. Calcule el factor de dilución geométrica media y multiplique por la sensibilidad de la endotoxina indicada en la etiqueta.

Dilución del producto

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

Factor de dilución

2

4

8

16

32

64

Réplica 1

+

+

+

-

-

-

Réplica 2

+

+

+

+

-

-

 

Punto final del factor de dilución

Log10 punto final

8

0.903

16

1.201

Media

1.054

Antilog10

11.3

Concentración de endotoxina = 0.125 UE/ml por 11.3 = 1.4 UE/ml

Bibliografía

1. Cooper, J.F., Levin, J., and Wagner, H.N. “Quantitative Comparison of in Vitro and In Vivo Methods for Detection of Endotoxin” J. Lab, Clin, Med., 78, p.128 (1971).

2. Hochstein, H.D. “The LAL Test versus the Rabbit Pyrogen Test for Endotoxin Detection; Update ’87.” Pharm. Technol., 11(6), p. 124 (1987).

3. Levin, J. and Bang, F.B. “Clottable protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endotoxin.” Thromb. Dieth. Haemonti., 19, p. 186 (1966).

4. Tai, J.Y. and Llu. T.Y. “Studies on Limulus Lysate, Isolation of Pro-clotting Enzyme.” J. Biol, Chem., 252, p. 2176 (1977).

5. Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December 1987.

6. “Bacterial Endotoxins Test.” The United States Pharmacopeia, most current version. U.S. Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.

7. Cooper, J.F., Weary, M.E., and Jordon, J,T. “The Impact of Nonendotoxin LAL-Reactive Materials on Limulus Amebocyte Lysate Analysis.” L. Parent, Sci Tech, 51(1), (1966).

8. Tsuchiya, M., Oishi, H., Takaoka, A., Fusamoto, M. and Matsuura, S. “Discrimination between endotoxin and (1–3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate.” Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). p. 2523 (1990).

Fabricado por:

Wako Chemicals USA, Inc.

LAL Division

1600 Bellwood Road

Richmond, VA 23237

Licencia No. 1762